GPRC6A在前列腺癌骨转移进程中的作用及机制研究

G protein-coupled receptor, family C, group 6, member A，(GPRC6A) is a prostate cancer (PCa) susceptibility gene that has been identified by genome wide association study and has been confirmed in multiple populations, however, so far little is known about its function in prostate cancer progression. Applicant's team has found that variations in GPRC6A gene are associated with aggressive PCa. Our study has validated that there are high expressions of GPRC6A in PCa glandular epithelium and PCa cell lines, and has confirmed silencing of GPRC6A can decrease the migration and invasion ability of PCa cells. The data indicates that GPRC6A can activate ERK signal pathway, and osteocalcin (Ocn) secreted by osteoblast can induce and activate the expression of GPRC6A. Therefore, we propose the hypothesis that GPRC6A may make PCa cells escape from prostate via ERK signal pathway and be involved in PCa bone metastases mediated by Ocn. To verify this hypothesis, this study intend to explore the role and mechanism of GPRC6A in the course of prostate cancer bone metastasis in PCa cell lines and SCID mice by using some methods such as RT-PCR, Western blot, siRNA, carrier transfection, co-culture and animal model, from cells and whole levels. This study will provide new ideas of effective prevention and new drug targets for PCa bone metastasis.

G蛋白偶联受体家族C型6A（GPRC6A）是全基因组关联研究鉴定并在多人群中确证的前列腺癌（PCa）易感基因，但迄今对其在PCa发生发展中的功能仍知之甚少。申请人所在课题组研究表明GPRC6A基因变异和进展性PCa关联，并验证GPRC6A在PCa腺上皮细胞和PCa细胞系高表达，体外证实沉默GPRC6A能够降低PCa细胞迁移和侵袭能力。资料表明，GPRC6A可激活ERK通路；PCa骨转移时成骨细胞分泌的骨钙素（Ocn）能诱导并激活GPRC6A表达。为此，我们提出假说：GPRC6A可能通过ERK信号通路使PCa细胞逃逸前列腺并在Ocn介导下参与骨转移。故本课题拟在PCa细胞系和SCID小鼠，采用RT-PCR、Western blot、siRNA、载体转染、共培养、动物模型等手段，从细胞-整体水平探讨GPRC6A在PCa骨转移进程中的作用及机制，为PCa骨转移有效防治提供新思路和药物作用新靶点。

前列腺癌（prostate cancer, PCa）转移是多因子参与的复杂过程，其机制并未完全清楚。研究表明G 蛋白偶联受体家族C 型6A（G protein-coupled receptor，family C，group 6，type A, GPRC6A）与PCa关联并可能参与PCa的进展，我们通过在PCa细胞、PCa组织及人群进一步研究GPRC6A在PCa转移中的作用及可能机制。首先，我们构建了两种GPRC6A过表达及一种低表达的慢病毒载体，经过慢病毒包装、感染及稳定细胞株筛选后建立了3种研究GPRC6A与PCa的工具细胞模型。然后，我们在GPRC6A过表达和低表达的细胞模型中通过划痕、transwell、QPCR、WB、免疫荧光及流式细胞分析等多种实验方法探讨了GPRC6A在PCa细胞转移、增殖和凋亡中的作用及可能机制，并在建立的细胞株上检测了生长因子表达来探讨肿瘤细胞与骨细胞互作。最后，我们通过生物信息学软件对前期人群研究中的数据进行分析来确定GPRC6A变异在增加PCa发病风险中的作用。结果显示：建立的3种GPCR6A过表达和低表达的PCa细胞模型能很好地进行PCa细胞表型及机制研究。GPRC6A过表达的PCa细胞迁移和侵袭能力升高，并且细胞增殖能力增强，凋亡能力下降，而GPRC6A低表达的PCa细胞迁移、侵袭及细胞增殖能力下降。机制研究显示GPRC6A可能通过ERK信号通路及TGFβ1信号通路影响EMT相关因子E-cad、ZEB、SNAIL等的表达来促进PCa细胞转移，通过ERK信号通路促进PCa增殖，通过升高凋亡抑制因子BCL2的表达来抑制凋亡。细胞互作研究表明GPRC6A的表达与EGF、TGFβ1及RUNX2表达趋势一致，EGF、TGFβ1及RUNX2可能通过促进成骨分化来联系肿瘤细胞和骨细胞之间的相互作用。人群研究数据分析表明，GPRC6A基因变异与进展性PCa关联，并且在能增高PCa发病风险的最好的基因-基因互作模型中有GPRC6A变异位点参与。综上，GPRC6A在PCa细胞的表达可以促进PCa的发生发展，本课题研究为PCa转移机制研究提供了新思路，为以GPRC6A为靶标进行PCa治疗的药物研发提供了新的参考数据。