一种新型膀胱癌侧群细胞的分离鉴定及其蛋白质组学研究

在国家自然科学基金青年基金资助下，申请人首次使用流式细胞仪激发一种新型荧光染料DCV，从膀胱癌细胞系中分离出侧群细胞，它们具有自我更新、多向分化及高致瘤性等肿瘤干细胞样生物学特征（CBT, IF=3.0），2009年该方法被SCI论文他引6次。.在此基础上，本项目拟以人膀胱癌SW780细胞为研究对象，使用DCV染料分离出膀胱癌侧群细胞与普通癌细胞，确证膀胱癌侧群细胞的肿瘤干细胞样生物学特征；运用双向电泳(2-DE)联合质谱分析（MS）等蛋白质组学技术，检测膀胱癌侧群细胞和普通癌细胞之间的差异表达蛋白，结合生物信息学分析，绘制差异蛋白质图谱；筛选出维持膀胱癌侧群细胞"干性"的主要靶蛋白，应用RNAi技术沉默靶蛋白基因，研究目标靶蛋白和基因在维持膀胱癌侧群细胞生物学特性的作用，确定它们在信号传导通路中的上下游关系。这将为阐明膀胱癌发生的分子机制开辟新思路，也可为探索其它癌症起源的共性提供资料。

第一部分： 目 的 观察人膀胱癌SW780细胞系中SP是否具有肿瘤干细胞样生物学特征。方 法 SW780细胞体外培养，用DCV荧光染料分析SP细胞比率。分选SP与NSP细胞群落后体外培养扩增。软琼脂克隆集落生成实验比较SP与NSP细胞的体外单克隆生长能力。SW780细胞转染绿色荧光蛋白质粒后，混合软琼脂克隆集落生成实验验证克隆的单细胞来源。RT-PCR比较ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1等基因表达差异。结 果 SW780细胞的SP比率为1.6%，可生成SP与NSP细胞。SP体外单克隆生长率显著大于NSP细胞(P＜0.01)。半定量RT-PCR表明SP的ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1基因表达显著高于NSP。结 论 流式细胞仪激发DCV荧光染料可分离肿瘤干细胞样特征的SP细胞。..第二部分：目的 从人膀胱癌HTB-1细胞系分选出侧群细胞(SP)并研究其生物学特征。方法 人膀胱癌HTB-1细胞培养后分析SP含量，分选出高纯度SP与非侧群细胞(NSP)。分别体外扩增后再分析SP含量。软琼脂克隆集落生成实验比较SP与NSP的体外单克隆生长能力。悬浮肿瘤球实验比较SP与NSP自我更新能力。裸鼠移植实验比较SP与NSP的成瘤性。结果 人膀胱癌HTB-1细胞的SP比率为0.93%。SP可产生SP与NSP细胞。SP体外单克隆生长率显著大于NSP (P＜0.01)。SP体外悬浮肿瘤球生长率显著大于NSP细胞(P＜0.01)。最少种植1000个SP细胞在裸鼠形成移植性肿瘤（HTB1 2/12）。结论 首次分析人膀胱癌HTB1细胞系的SP含量。SP细胞具有体外单克隆生长、自我更新能力以及体内移植成瘤性。..第三部分：膀胱癌是一种全球性的常见恶性肿瘤，具有术后高复发率及复发后快速进展的特点，其分子机制尚未被完全阐明。MicroRNA是一种23个核苷酸长度的非编码RNA，研究表明其在膀胱癌发生及发展的各个过程中起重要作用。在此我们分别综述microRNA在膀胱癌中的表达谱、表达的调控、生物学功能和临床意义。MicroRNA在膀胱癌细胞中的表达能通过表观遗传学改变和中间产物的缺陷而上调或下调。MicroRNA在膀胱癌细胞中的异常表达涉及到细胞周期组织、细胞凋亡、细胞增殖、转移侵袭、细胞耐药等一系列生物学功能。大量microRNA，包括尿液中的microRNA，