长链非编码RNA 在骨不连发生、发展中的作用及其机制研究

Long noncoding RNA (lncRNA) is involved in regulation of the important activities of organism’s growth, development, and differentiation. LncRNA also plays important roles in maintaining the the pluripotent state of stem cells. Base on our previous study, we found that significant increased levels of Twist1 and Twist1 natural antisense transcripts (Twist1-NATs, one of the lncRNAs) in nonunion tissues comparison to paired fracture union tissues. Importantly,we also demonstrated that Twist1-NATs can regulate the ability of osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells( hBMSCs). In the current study, we will figure out the mechanism of stabilizing Twist1 mRNA by Twist1-NATs by CRISPR/Cas9 system. What's more, we will try to expose what effects Twist1 and Twist1-NATs on hBMSCs osteogenic differentiation. We will also find the correlation between level of Twist1/Twist1-NATs and prognosis of nonunion. These studies will help us to understand the functional roles of Twist1-NATs and Twist1 in the occurrence and development of nonunion. It might be a strategy for new diagnostic and therapeutic methods for nonunion.

长链非编码RNA（lncRNA）在生物体生长发育及分化中发挥重要作用，是干细胞保持多能性及定向分化的关键调节因子。基于前期研究，我们发现Twist1基因内源性反义转录产物（Twist1-NATs，lncRNA的一种）在骨不连组织相对骨折正常骨愈合组织表达显著增加。体外实验证实Twist1-NATs具有调节hBMSCs成骨分化的能力,并证实Twist1-NATs可正向调节Twist1及其信号通路。本项目中，我们将运用CRISPR/Cas9技术靶向Twist1-NATs阐明其稳定Twist1 mRNA的具体作用机理；深入研究Twist1-NATs对hBMSCs成骨分化的影响及分子机制；建立Twist1-NATs的表达与骨不连发生、发展之间的相关性，从一个全新角度诠释及理解骨不连发生、发展的分子生物机制，有望为骨不连治疗提供新策略和方法。

本项目首先收集多发骨折术后部分骨折愈合、部分骨折萎缩骨不连患者的组织标本，通过高通量测序进行mRNA和lncRNA表达谱筛查，发现Twist1基因内源性反义转录产物（Twist1-NATs）在骨不连组织相对骨折正常骨愈合组织表达显著增加。接着，我们扩大组织样本后采用qPCR技术验证高通量测序结果，结果提示Twist1-NATs和Twist1在骨不连组织中表达上调。同时，在体外hBMSC中，我们证实Twist1-NATs具有调节hBMSCs成骨分化的能力，并证实了Twist1-NATs可正向调节Twist1及其信号通路。除此以外，高通量测序结果发现 lncRNA ENST00000563492 在骨不连组织中表达下调，并用qPCR进一步证实。同时，在体外hBMSC中，提示lncRNA ENST00000563492能通过上调CDH11的表达促进hBMSC的成骨诱导分化。另外，lncRNA ENST00000563492可以通过增强hBMSC成骨分化过程中VEGF的表达来改善成骨-血管生成的偶联过程。体内实验进一步证实，lncRNA ENST00000563492可显著促进体内hBMSC的成骨分化。以上结果表明Twist1-NATs和lncRNA ENST00000563492可能是骨不连治疗的新靶点。