外源β-胡萝卜素基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径中关键酶的影响

以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A（MATa ura3,leu2）和CEN.PK113-7D(MATa)为原始菌，采用改变基因拷贝数的方法构建不同合成水平的β-胡萝卜素重组菌株，在分批和连续培养条件下，研究各菌株甲羟戊酸途径中关键酶的表达、活性以及相关代谢产物合成水平的变化规律，分析其差异，以期揭示外源β-胡萝卜素基因表达条件下微生物甲羟戊酸途径的代谢调控规律和机制，发现影响β-胡萝卜素合成的关键因素。本研究对于阐明微生物细胞调控类胡萝卜素物质合成的机制，加深对甲羟戊酸途径调控本质的认识将具有重要的学术意义和应用价值。同时，本课题的研究结果也可为利用微生物细胞合成其它类异戊二烯产物的研究提供有益的借鉴。

课题组通过改变β-胡萝卜素基因拷贝数获得了多株β-胡萝卜素合成水平差异的菌株，并利用代谢工程的策略进一步提高了其合成水平, 已经获得了多株代谢差异显著的重组菌株（17株），最高和最低β-胡萝卜素水平相差7.6倍。但同时发现，随着产物水平的提高，细胞生长受到的抑制作用逐渐增强。.（1）ERG20基因是关键酶基因，其表达水平随着目的产物合成水平的增加而提高；.（2）通过基因调控显著提高β-胡萝卜素合成水平：1）增加β-胡萝卜素基因拷贝数能够显著提高β-胡萝卜素合成水平，同时增加麦角固醇水平。随着产物水平增加，各个关键酶表达水平都有不同程度的提高，但细胞生长受到的抑制作用增加；过量表达关键酶基因HMG1或ERG20能够提高β-胡萝卜素水平，但高表达ERG20基因对细胞生长的抑制作用更加强烈；2）过量表达HMG1基因，同时抑制麦角固醇合成，以及利用甲羟戊酸途径代谢活跃的工业葡萄酒酵母菌作为宿主菌，能够显著提高β-胡萝卜素水平；.（3）利用发酵条件优化技术提高β-胡萝卜素合成水平：调控pH和温度将β-胡萝卜素产率提高到50.4 mg/L，据申请人所知，这是目前报道的利用酿酒酵母作为宿主菌合成β-胡萝卜素的最高水平;.（4）在项目实施过程中，建立了完善的代谢产物检测技术，包括糖代谢产物、类胡萝卜素、麦角固醇、乙酰辅酶A等物质；.（5）通过基因敲除研究重组菌在环境胁迫条件下的代谢变化：利用loxp-Kanmx4-loxp基因敲除法，敲除了编码过氧化氢酶的基因CTT1，研究β-胡萝卜素和抗氧化物酶在抵抗过氧化氢胁迫中的不同作用;.（6）建立了高效的类胡萝卜素高产重组菌快速筛选技术。通过平板初筛和摇瓶培养复筛可以快速、准确的筛选到细胞生长和β-胡萝卜素合成水平显著差异的菌株。. 根据已经得到的结果，我们认为，对于甲羟戊酸途径的调控，多基因协同调控更加有效，因为调控单个关键酶虽然能够提高产物水平，但由于中间产物的积累（其具有毒性），细胞生长都受到不同程度抑制。因此，下一步的工作主要是对各个关键酶进行协同精细调控，以避免中间代谢产物的积累，进一步提高类胡萝卜素物质的合成水平，从而阐明微生物细胞调控类胡萝卜素合成的分子机制。