续随子中巨大戟醇的生物合成途径和细胞定位研究

Ingenol, a complex macrocyclic diterpenoid possessing important anticancer and anti-HIV activity, only distributes in several Euphorbiaceae plants with trace content. And it is also the current industrial source of Picato, a first-in-class drug for the treatment of actinic keratosis. However, the problem of current supply of ingenol is that either the isolation from its natural source or the semisynthesis is fraught with difficulties for the very low yield. Completing elucidation of the biosynthetic pathways and establishing a metabolic engineering and synthetic biology approaches for ingenol shall be a novel promising way to solve the problem of supply. To elucidate the biosynthetic pathway of ingenol, we have established callus tissue of Euphorbia lathyris for ingenol. On this basis, to clarify the source of carbon skeleton, origin of oxygen, and biosynthetic mechanism of ingenol gradually, 13C-labeled precursors and 18O2 will be administered to plants and a retrobiosynthetic approach using 13CO2 for labeling will be used. To pinpoint the biosynthetic sites of ingenol from organ and tissue to cell, a method of microchemical analysis using LMD-LCMS will be used to study their cell-specific localization in E. lathyris. Additionally, to prove the biosynthetic pathway and localization of ingenol, cell free enzyme incubations with different supposed precursors will be systemically investigated. The discovery of the biosynthetic pathway and localization of ingenol may pave the way for biotechnological production of ingenol, and provide valuable reference to elucidate the biosynthetic pathways of other complicated natural products.

巨大戟醇是一种结构复杂的大环二萜类成分，微量分布于少数大戟科植物中，其不仅具有显著的抗癌抗艾滋等活性，还是新药Picato的原料，但化学合成或植物提取的产率极低，基于机理明确的生物合成是解决巨大戟醇低成本生产难题的最佳途径。本项目拟针对目前巨大戟醇生物合成途径仍存在较大争议的问题，在前期研究基础上，通过愈伤组织碳13前体饲喂、氧18氧气培养和整株植物碳13二氧化碳培养，分离得到经稳定同位素标记的巨大戟醇及其中间体，进行核磁共振及质谱结构解析，确定其标记位点、同位素丰度及达到稳定态速率，依次阐明巨大戟醇的碳骨架来源、氧原子来源和合成机理；运用激光显微切割-液质联用技术，按器官—组织—细胞次序，逐步定位续随子中巨大戟醇的合成位点；并运用无细胞酶促反应对上述结论进行验证，阐明巨大戟醇的生物合成途径和位点，为巨大戟醇的生物合成奠定理论基础，为其他复杂天然产物的生物合成研究提供参考。

巨大戟醇是一种结构复杂的大环二萜类成分，微量分布于少数大戟科植物中，其不仅具有显著的抗癌抗艾滋等活性，还是新药Picato的原料，但化学合成或植物提取的产率极低。巨大戟醇生物合成是解决其低成本生产难题的最佳途径,然而巨大戟醇生物合成途径和合成位点尚不清楚。本项目针对上述问题，从化学角度进行了深入研究，取得了预期研究成果。首先，从续随子及其体外组织培养物中共分离鉴定化合物45个，其中新大环二类成分8个，并鉴定得到巨大戟醇生物合成关键中间体——(12Z)-Lathyrane型续随子烷二萜。其次，选育出了续随子巨大戟醇高产细胞系El-A6，巨大戟醇产量达到了2.8mg/L；对续随子巨大戟醇高产细胞系进行稳定同位素标记前体饲喂实验，分析了饲喂产物的标记位点和模式，明确了巨大戟醇分子中碳原子来源于质体MEP途径，而氧原子的来源于O2；结合化学沟通实验，解析了巨大戟醇的生物合成途径。然后，采用UPLC-Q/TOF-MS代谢组技术，分析了巨大戟醇在61种大戟科植物中的分布情况，发现巨大戟醇高含量植物资源3种，并发现UV照射能显著提高大戟属植物中巨大戟醇的含量。最后，采用代谢组和转录组关联分析方法，明确巨大戟醇主要在续随子的根部和种子中合成；进一步通过激光显微切割-液质联用技术，确定了巨大戟醇的主要合成位点在续随子根皮细胞和种子胚中。上述研究成果为后续巨大戟醇合成生物学元件的挖据提供了重要科学依据。发表SCI论文7篇，中文核心期刊论文1篇，均标注基金项目资助，申请发明专利4件，培养研究生3名。