电针减轻急性缺血性脑卒中溶栓治疗中血脑屏障损伤及延长溶栓时间窗的实验研究

Clinical studies suggested Recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) improve the outcome for ischemic stroke patients at early time intervals after arterial occlusion, but its use is limited to the first hours after stroke onset due to an increased risk of hemorrhagic transformation over time resulting in enhanced brain injury. Detrimental effects of rt-PA are derived from its ability to activate MMP-9 that in turn contributes to the breakdown of BBB. However, there are little effective treatments to inhibitor MMP-9 in clinical practice. Out previous research proved electro-acupuncture could improve treatment outcome at acute period of ischemic stroke. Laboratory results showed MMP-9 levels in the ischemic focus were upgraded by electro-acupuncture. Our project applies MCAO mouse models, mouse MRI, immune colloidal gold technique，and zymography technique to study the volume and the MMP-9 and LRP1 expression in ischemic focus as well as the condition of BBB. Our purpose of this project is to investigate the mechanism of electro-acupuncture involving inhibition of disruption of BBB and protection acute ischemic patients from hemorrhagic transformation when treated with thrombolysis.

在急性缺血性脑卒中（CIS）发生后静脉用溶栓剂阿替普酶（rt-PA）治疗可以改善患者结局。但溶栓剂可增加致命性颅内出血的发生率，且治疗时间窗短，限制了它的使用。研究表明，rt-PA触发LRP1诱导的基底金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达上调，进而破坏血脑屏障（BBB）的完整性，为溶栓过程中颅内出血的主要机制。我们的临床研究显示电针在CIS患者超早期介入治疗可改善中风治疗结局。实验研究显示，电针治疗可以下调CIS患者的缺血灶局部的MMP-9水平。本项目以MCAO小鼠模型研究为对象，采用小鼠MRI，免疫胶体金技术，明胶酶谱法等方法，观察研究电针结合溶栓在 CIS急性期介入治疗后，小鼠脑部局部缺血灶的体积，血脑屏障损坏情况及MMP-9蛋白，LRP1蛋白在缺血半球的表达，探讨电针能减轻溶栓治疗时血脑屏脑屏障损伤，减少颅内出血风险，延长溶栓治疗时间窗的机制。

【研究目标】探索电针在急性缺血性脑卒中后溶栓时对MCAO模型小鼠脑部损伤及保护血脑屏障作用研究及电针在急性期延长MCAO模型小鼠溶栓治疗时间窗的作用及其生物学机制。【方法】本项目第一部分以MCAO小鼠模型研究为对象，C57BL/6小鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组、溶栓组。正常组和假手术组不给予任何治疗，其中后三组脑缺血造模成功后2h 后干预。电针组注射rt-PA后开始电针治疗（百会、风府穴）；溶栓组给予静脉注射rt-PA，模型组给予静脉注射生理盐水。各组小鼠均12h 后测神经功能评分，评估神经功能损伤情况； 12h 后各组小鼠进行核磁共振仪MRI成像观察脑梗死灶体积， Evans blue 渗漏法测定OD值观察血脑屏障通透性，干湿称重法测定脑水含量，应用Western blot测定MMP-9、LRP1 蛋白表达情况。第二部分小鼠MCAO造模后分为模型组（注射生理盐水），溶栓组（6h给予静脉注射rt-PA）,电针组（4h电针+6h溶栓）以小鼠MRI法观察小鼠脑部局部缺血灶的体积，Zea Longa评分，评估各组小鼠神经功能损伤情况。结果①溶栓组、电针组、模型组的Zea Longa评分与假手术组相比，均有统计学差异(P<0.05),与溶栓组比，电针组小鼠评分明显降低(P <0.05)。②MCAO 模型小鼠2h后溶栓组静脉注射rt-PA，电针组rt-PA+EA 干预治疗；电针组干预后梗死灶减少(P<0.05)；有统计学差异。③在电针干预后有效降低EB 的外渗和减轻了脑水肿；正常组与溶栓组比(P<0.05)；溶栓组与电针组比，OD 值降低，P <0.05。④通过电针干预治疗后，溶栓组与电针组比较，电针组MMP-9、LRP1 水平表达下降(P<0.05)。⑤电针在将扩大溶栓时间窗至6小时的治疗中，组间MRI脑梗死体积与神经功能评分比较无明显差异(P>0.05)【结论】电针风府，百会穴协同溶栓治疗可以改善MCAO小鼠神经功能损伤，减少脑缺血损伤小鼠脑梗死体积，保护小鼠血脑屏障，其机制可能是通过抑制脑缺血损伤后脑组织MMP-9、LRP1的表达。本项目研究结果为电针在急性中风特别是溶栓病人中的应用提供了实验研究依据。