盐生植物中华补血草内生放线菌资源及其盐胁迫下的促生作用机制研究

Endophytic actinobacteria，the unexplored new microbial resource, have high diversity and divserse functions, such as plant growth promoting（PGP） and stress protection. The'Pioneer plant'Limonium sinense has very important clinical application value. It's likely that this plant hold diverse endophytic actinobacteria and the microorganisms may contribute to the host's stress tolerance ability. Today, however, we know little information about the endophytic actinobacterial diversity and their ecological function. This project plans to explore the endophytic actinobacterial diversity and study the plant growth promoting effect and the mechanism under salt stress:(1).analysis the endophytic actinobacterial diversity and distribution characteristics using pure culture and molecular ecological techniques; (2). to evaluate strains PGP potential and screen the endophytes with diverse PGP characteristics and high and stable activities,and study the promoting effect under salt stress; (3).to clarify the PGP mechanisms by comparing with inoculated and un-inoculated plants physiology and biochemistry and protein level differences in response. The project results will be rich of Chinese extreme habitats plant endophytic actinomycetes resources and ecological research and have important scientific significance to reveal the relationship between endophytic actinomycetes and plants, and provide the scientific base for the further utilization of endophytic actinobacterial resource and will also provide new idea and strategy for halophyte stress tolerance.

植物内生放线菌物种丰富，具有促生、提高宿主抗逆性等多种功能，是一类潜力巨大、尚待开发的新微生物资源。中华补血草具有重要的临床药用价值，作为盐地改造的"先锋植物"，其不仅可能蕴含丰富的内生放线菌群，而且内生放线菌可能与其盐胁迫逆境适应相关。迄今，该植物内生放线菌多样性及生态功能尚不清楚。本项目拟在探明中华补血草内生放线菌多样性基础上，开展盐胁迫下内生菌促生作用机制研究：（1）通过纯培养分离与分子生态学技术分析内生放线菌多样性和分布特点；（2）评价菌株促生性能，筛选具多种促生性能的高效功能菌株，研究内生菌在盐胁迫下的接种效应；（3）通过对比接种与未接种内生菌植物生理生化与蛋白质水平的差异响应，阐明内生放线菌的促生作用机制。研究结果将进一步丰富极端生境植物内生菌资源与生态研究内容，对揭示内生菌与植物相互关系具有重要科学意义，为内生放线菌资源深入利用提供科学依据，也为盐生植物逆境适应提供新的策略。

本项目以江苏沿海滩涂药用盐生植物中华补血草为对象，研究内生放线菌多样性、盐胁迫下的促生作用和机制。通过纯培养方法改进，分离获得200多株内生放线菌，分布于10多个属，其中节杆菌和链霉菌为最优势类群。通过多相分类研究发表放线菌新属1个，新种5个。基于Miseq PE300平台的16S rRNA基因高通量测序发现根、叶、根际和根围土中放线菌门的比例分别为1.72%、4.29%、24.65%、29.89%，属水平探测到296个属，其中放线菌共57个属，包括Blastococcus, Ilumatobacter等稀有放线菌类群，物种多样性十分丰富。以ACC脱氨酶为主要指标，筛选了菌株产生IAA、固氮、溶解有机磷、产生铁载体等多种促进植物生长的特征及耐盐能力的检测，获得了一批潜在促生菌株。以盐胁迫下中华补血草种子萌发、组培苗生长试验获得了4株具有较好促生接种效用的内生菌。继续通过盆栽试验研究发现节杆菌属（KLBMP 5180）、链霉菌属（KLBMP 5084）和芽孢杆菌属（KLBMP 4941）的三株菌的解盐促生能力较强。通过植物生理检测发现接种KLBMP 5180和KLBMP 5084都能提高宿主的抗氧化酶活性，降低细胞膜的膜脂质化程度，减少活性氧的积累，促进脯氨酸积累，调节离子代谢平衡，减少Na+离子毒害，从而增强宿主抵御盐胁迫的能力。转录组研究鉴定了接种KLBMP 5180后叶片的差异表达基因，提出盐胁迫下主要促进宿主叶片中的氨基酸转运代谢、以及次生代谢产物如苯丙烷类和黄酮的生物合成来抵御盐胁迫，而无盐条件下主要通过调节宿主激素合成促进生长。通过完成图解析了三株菌的基因组，发现了大量与植物生长促进以及盐环境适应相关的功能基因，初步揭示了盐胁迫下内生放线菌的促生机制。此项研究对于揭示植物内生放线菌的生态功能具有重要科学意义，为利用内生放线菌促进重要盐生植物的生长与逆境适应、以及其它农作物的盐土栽培提供了理论依据，具有进一步研究和开发价值。项目共发表论文13篇，其中SCI论文12篇，参与编写著作1部，申请发明专利2项，获得2016年教育部科技进步二等奖和江苏省教育厅科技进步三等奖各1项，一名硕士生获得江苏省优秀硕士学位论文。