T6SS在霍乱弧菌新发菌株中的转录调控机制研究

Type VI Secretion System (T6SS) has been found in many Gram negative bacteria, and has been demonstrated to play important roles in bacterial fitness. The mechanism of Vibrio cholerae T6SS transcriptional regulation has been studied mainly in early pandemic strains and environmental strains. My previous studies indicate the recent pandemic H1 strain is more virulent, and its T6SS has higher activity compared to early pandemic strains and environmental strains; however, how T6SS activity is up-regulated in H1 strain is unknown. My preliminary data has demonstrated that there was a new gene, designated as vca0106.5 in this study. Knockout of this gene results in the up-regulation of T6SS gene transcription and other phenotypes. In this proposal, I hypothesize that in H1 strain there exists a new regulation pathway mediated by VCA0106.5. I propose to use in-frame deletion knockout method, RNAseq, ChIP-seq methods to study the mechanism of the VCA0106.5-mediated regulation on the transcription of T6SS genes and other genes. This study will not only uncover a novel regulation mechanism on bacterial T6SS, but also provide knowledge and tools for engineering T6SS for therapeutic purpose.

六型分泌系统（T6SS）广泛存在于革兰氏阴性菌中，并被证实参与细菌适应性等多种重要生理功能。T6SS的调控机制研究目前主要基于霍乱弧菌早期菌株以及环境菌株。近年来，申请人的既往研究表明，霍乱弧菌新发菌株（H1菌株）具有更强的致病性，其T6SS具有更高的活性，但其T6SS活性的调控机制不明。初步数据表明，在T6SS主基因簇中存在一个未被注释的基因（本项目命名为vca0106.5）。敲除该基因会导致T6SS基因转录上调以及其他表型。本项目据此提出假设：在新发菌株H1中存在一种由VCA0106.5介导的转录调控新通路。在BSL2生物安全实验室中，本项目拟利用基因无痕敲除、RNAseq、ChIP-seq等技术，阐明VCA0106.5对T6SS和其他基因的调控机制。本项目不仅可揭示细菌T6SS的调控新机制，而且可为T6SS的工程化利用提供新的理论基础和基因元件。

细菌的六型分泌系统（T6SS）广泛存在于革兰氏阴性菌中，并被证实参与细菌适应性等多种重要生理功能。靶向攻击细菌分泌系统的核心蛋白组分来开发小分子药物也为应对病原菌耐药性、多重耐药性等问题提供了有效的途径。这都充分表明研究细菌蛋白分泌系统具有十分重要的社会意义及经济价值。首先，基于多突变菌株的转录组测序数据并结合GO 富集和 KEGG 富集结果，发现 vipA 的缺失会引起与霍乱弧菌群体感应相关基因（hapR）的转录水平显著降低。vipA 基因在霍乱弧菌 H1 菌中是一个具有多重功能的基因，一是编码 T6SS 鞘结构蛋白，二是参与 T6SS 调控；推测 hapR可能参与 H1 株中 vipA 对 T6SS 基因簇的转录调控，具体机制正在深入挖掘中。同时项目成员发现启动子在线预测vipA上游存在转录起始位点，然而PvipA-lacZ转录融合子的lacZ在vipA突变菌株中与在野生型菌株中相比无差异，说明VipA没有直接作用于vipA 上游的顺势作用原件。通过DNA pulldown寻找与vipA 启动子直接相互作用的蛋白，发现宿主整合因子IHF、CAMP相应转录因子CRP等均可能与vipA上游序列相互作用。凝胶阻滞迁移实验证实了IHF complex 与vipA上游-1至-95区域序列有体外相互作用，证明IHF complex 可能参与了H1菌株T6SS主基因簇的调控，进一步机制正在开展过程中。此外，项目成员系统性整理总结了重大疾病中T6SS介导的有害菌致病机制以及针对细菌分泌系统开发靶向干预策略与手段的既往研究，并提出了如何进一步挖掘细菌分泌系统（包括T6SS）在人类重大慢性/疾病疾病中的作用的方法以及靶向清楚的潜在技术研发方向，为此领域内的科研工作提供了重要参考与借鉴。在项目执行期间，共发表了高水平学术论文3篇，待发表1篇；培养了国家级青年人才1名；培养了博士研究生1名，硕士研究生2名；项目投入经费26万元，执行率100%。项目研究成果达到了国际先进水平。