特殊环境下海洋小球藻油脂积累的分子机制研究

利用富油微藻生产生物柴油是缓解化石燃料日益匮乏的重要途径之一。提高微藻油脂含量是降低微藻生物柴油生产成本、使之实现产业化的关键。我们前期研究结果表明，某些特殊环境条件（缺氮或富铁）可以促使海洋小球藻（Chlorella vulgaris）细胞内大量积累油脂，这种现象产生的原因尚不明确。本研究拟以富铁和缺氮培养条件下的积脂小球藻和正常培养条件下的未积脂小球藻为试材，应用cDNA-AFLP、实时荧光定量PCR等现代生物学研究技术，全面、系统地分析不同培养条件下及不同培养阶段小球藻的生理生化变化及其基因的差异表达，筛选促进小球藻油脂积累的关键基因，寻找特殊环境刺激小球藻油脂积累的调控点，以期揭示特殊环境刺激小球藻油脂积累的分子机制，为人工调节小球藻油脂积累、降低微藻生物柴油生产成本提供基础，同时也为其它植物脂类代谢研究提供参考。

提高微藻细胞中油脂含量是降低微藻生物柴油生产成本的关键。一些特殊环境（如缺氮培养）能使微藻细胞内大量积累油脂，这种现象产生的原因尚不明确。本项目研究了全氮与缺氮条件下小球藻（Chlorella vulgaris）生理变化和基因表达变化，探讨了缺氮诱导小球藻积累油脂的可能分子机制。.小球藻细胞油脂在缺氮培养条件下显著增加，生长量下降。缺氮提高了藻细胞中MDA、果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性多糖和淀粉含量，降低了可溶性蛋白含量、叶绿素a、b含量及其比值和48h放氧速率。.建立了从小球藻中提取总RNA的方法。以全氮、缺氮培养24h、48h样品及对照为试材进行了转录组测序，共获得24Gb有效数据，1.77亿条有效序列，拼接为29499条genes,34987条sogenes。其中16683条isogenes得到比对注释结果，6245条注释到GO号。共5202条序列注释到292个代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程等相关途径，以嘌呤、嘧啶、氧化磷酸化、糖酵解、脂肪酸等代谢过程注释序列最多。.5个样品中存在大量差异表达基因，数字表达分析与定量PCR分析结果一致。在培养24h样品中发现479条差异表达的isogenes，其中191条富集到109个代谢途径；在培养48h样品中发现155条差异表达的isogenes，其中71条富集到43个有关代谢途径。.综合研究结果，缺氮诱导小球藻油脂积累可能分子机制为：缺氮引起了环境逆境信号，使热激蛋白基因、核酸内切酶基因及细胞周期末期促进复合物基因等基因上调表达，使缺氮培养的小球藻提前进入细胞生长后期，碳流向脂肪合成。缺氮环境下，氨基酸脱氨酶和氧化酶基因上调表达，氨基酸脱氨、氧化、水解加快，为脂肪合成提供碳架。醛脱氢酶基因和天冬氨酰转氨酶基因等上调表达，导致NADH和草酰乙酸等TCA的中间产物增多，同时丙酮酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶等参与TCA循环的基因在缺氮环境下下调表达，从而使TCA循环减弱，更多碳源流向脂肪酸合成。缺氮环境下，小球藻油脂积累的碳源不直接来于糖酵解生成的丙酮酸，而可能来自乙酸盐，而乙酸盐可能来自氨基酸。小球藻利用用Ⅱ型FAS，将乙酸直接引入到脂肪合成中。推测脂肪合酶fabF基因、醛脱氢酶基因、氨氧化酶基因、天冬氨酰转氨酶基因和细胞周期末期促进复合物基因是缺氮条件下小球藻油脂积累的关键基因。