整合素αvβ6在启动FMDV感染易感动物过程中的作用研究

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) infects cattle, sheep, swine, and other animal, caused Foot-and-mouth disease (FMD), which lead to a serious harm to the development of animal husbandry. There are seven serotypes, easy mutation of virus, and no cross-protection among vaccines against different serotypes, so a single vaccination is too difficult to prevent and control FMD. Viruses infect host via recognizing and binding to viral receptor on surface of host cell, once viral receptor is blocked or knockout, no viral infection occur, so it will be a new strategy for control and eradication of viral disease. Although studies have shown that integrin αvβ6 is the major receptor of FMDV in vitro and using suckling transgenic mice, it is not clear whether αvβ6 is the key receptor that initiates viral infection of sensitive animals.In this study,β6+/- and β6-/- transgenic dairy cattle will be obtained using homologous recombination, zinc finger nuclease, and somatic cell cloning techniques. The transgenic fetal epithelial cells will be then prepared and inoculated with FMDV, it will be confirmed whether integrin αvβ6 is the sole receptor for viral infecting epithelial cells based on the capability of transgenic cell against FMDV. The ability of transgenic dairy cattle against FMDV will be determined based on viral challenge assay, and then it will be assessed whether αvβ6 is the key receptor to initiate viral infection of natural sensitive animals and become the target for studies of anti-FMDV.

口蹄疫病毒(FMDV)可引起牛、羊等发生口蹄疫（FMD），该病严重影响畜牧业的发展。FMDV共有7个血清型，易发生变异，不同血清型疫苗间没有交叉保护，因此，利用疫苗免疫的单一手段难以控制和消灭FMD。病毒受体是能够被病毒识别并与之结合, 进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，若封闭或敲除关键受体基因可阻断病毒感染，进而达到防控病毒病的目的。体外及乳鼠实验研究表明，整合素αvβ6是FMDV感染体外细胞及实验动物的最主要受体，但是否是启动天然易感动物感染的关键受体，尚待验证。本研究拟利用同源重组、锌指酶及体细胞克隆等技术，获得β6+/-及β6-/-转基因奶牛及其胎儿；制备转基因胎儿上皮细胞，检测其对强毒感染的抗性，鉴定αvβ6是否是强毒感染上皮细胞的唯一受体；通过攻毒实验检测转基因奶牛对FMDV感染的抵抗力，分析αvβ6是否是启动FMDV感染易感动物的关键受体，探讨其能否成为抗FMD研究的靶点。

口蹄疫病毒(FMDV)可引起牛、羊等发生口蹄疫（FMD），该病严重影响畜牧业的发展。利用疫苗免疫的单一手段难以控制和消灭FMD。病毒通过受体感染宿主细胞，若封闭或敲除关键受体基因可阻断病毒侵入，进而达到防控病毒病的目的。体外及乳鼠实验研究表明，整合素αvβ6是FMDV感染体外细胞及实验动物的最主要受体，但是否是启动天然易感动物感染的关键受体，尚待验证。本课题的研究内容、重要结果、关键数据如下：.1、获得整合素β6+/-转基因奶牛及奶牛胎儿.构建可替换β6基因的重组打靶质粒4个；选取45-55日龄的奶牛胎儿，制备胎儿成纤维细胞系10株；将重组打靶质粒转染牛胎儿成纤维细胞，通过跨越式PCR鉴定，筛选β6+/-细胞系4株；将去核的成熟卵母细胞与核供体细胞融合，获得了212枚β6+/-转基因胚胎；将克隆囊胚移入已同期的82头受体牛的子宫角内，获得45-60d胎儿3头，另外出生转基因犊牛2头。.2、获得整合素β6 -/-转基因奶牛胎儿.构建可识别并剪切整合素β6亚基基因的ZFN重组表达载体，将其转染牛胎儿成纤维细胞，经序列测定分析鉴定，筛选获得整合素β6亚基基因被双敲的成纤维细胞系5株；利用体细胞克隆技术获得45-60日龄的6-/-转基因胎儿3头。.3、制备转基因奶牛胎儿舌上皮原代细胞.取胎儿舌皮肤组织，经胶原酶和胰蛋白酶混合液消化后，在含10%胎牛血清的DMEM:F12营养液中培养，获得β6-/+、β6-/-转基因牛胎儿舌上皮原代细胞各3株，经Western blot检测，前者β6蛋白表达显著下降，后者未检测到其表达。.4、检测敲除整合素β6亚基基因的奶牛胎儿舌上皮原代细胞的抗FMDV感染的能力.100TCID50的O型 FMDV分别接种β6+/+、β6+/-及β6-/-奶牛胎儿舌原代上皮细胞后，测定TCID50及病毒RNA。与对照β6+/+相比，β6基因被敲除后的奶牛胎儿舌上皮原代细胞的病毒滴度及病毒RNA明显下降，表明αvβ6是FMDV自然感染易感动物上皮细胞过程关键的受体。然而，即使完全敲除β6基因，也不能全部抑制病毒的复制，表明αvβ6不是FMDV自然感染的唯一受体。.本研究获得授权的国家发明专利3项，获得省部级科技奖励2项，发表SCI论文7篇。