RTA2基因影响脂筏形成导致白念珠菌耐药的机制研究

本项目前期研究证明RTA2 是钙调神经磷酸酶通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的必需基因，Rta2p 是鞘脂骨架成分长链碱的转运蛋白；有研究提示脂筏参与白念珠菌耐药性的形成。本项目拟进行以下研究：（1）考察白念珠菌Rta2p 在细胞上脂筏区和非筏区的分布：①建立提取和鉴定细胞膜上脂筏区域的方法，利用Rta2p抗体考察Rta2p 在细胞膜上脂筏区和非筏区的分布，并利用脂筏抑制剂考察Rta2p 在细胞膜上脂筏区和非筏区的分布；②考察Rta2p 的GFP 融合蛋白在白念珠菌细胞膜上的分布，比较脂筏形成抑制前后Rta2p 在细胞膜上的分布变化；（2）考察白念珠菌RTA2 基因对细胞膜脂筏形成的影响：考察RTA2 基因缺失前后对脂筏区已知蛋白在脂筏区和非筏区分布的影响，并利用蛋白质组学技术考察RTA2 基因对脂筏区分布蛋白种类和含量的影响。阐明RTA2 影响脂筏形成导致白念珠菌耐药的分子机制。

随着癌症放化疗、器官移植、艾滋病患者的增加和导管技术的发展，广谱抗生素、肾上腺皮质激素、细胞毒药物和免疫抑制剂的长期不合理应用，白念珠菌做为人类主要的机会致病真菌，其发病率和死亡率不断上升。目前可供临床选择的抗真菌药物数目有限，氟康唑因其具有良好的生物利用度和较少的不良反应成为临床应用最广泛的抗真菌药物，长期治疗和重复给药过程中产生了快速发展的耐药性，这是临床治疗失败的主要原因。在本项目前期研究中，我们发现钙离子能够激活白念珠菌钙调神经磷酸酶通路从而上调RTA2基因的表达，最终能够显著降低白念珠菌对氟康唑的敏感性。在本项目研究中，我们利用基因敲除的方法证明RTA2基因编码蛋白能够以钙调神经磷酸酶通路依赖方式影响氟康唑的抗白念珠菌活性，其机制是由于RTA2基因编码蛋白能够显著减弱氟康唑对白念珠菌细胞膜的损伤；进一步研究发现，RTA2基因编码蛋白位于白念珠菌细胞膜脂筏区域，但并不影响脂筏的形成，脂筏（lipid rafts）是细胞膜中富含麦角甾醇和鞘脂（肌醇磷酰鞘氨醇及其衍生物）的微结构域（microdomain）；利用蛋白质组学方法发现：RTA2基因影响脂筏区域其它蛋白的锚定，其中 有5个蛋白包括Pma1p, Gas1p homologue, Erg11p, Pmt2p和Ali1p已被报道位于白念珠菌脂筏区域，而Erg11p是氟康唑的作用靶点。体内研究发现：RTA2基因自身并不影响白念珠菌的毒力，但是RTA2基因缺失能够显著增加氟康唑的体内疗效，而RTA2基因回复或高表达菌能够显著降低氟康唑的体内疗效，RTA2基因对氟康唑体内疗效的影响依赖于钙调神经磷酸酶通路的调控。因此，本项目研究证明RTA2基因能够作为开发新型抗真菌药物的潜在靶标，为设计新型抗真菌药物，克服真菌耐药性，奠定理论基础。