亚洲1型口蹄疫病毒兔化弱毒株致弱分子机理研究

亚洲1型口蹄疫兔化弱毒株- - 中国保山兔化弱毒株（ZB/CHA/58(att)株）是我国培育成功的一株弱毒疫苗株，曾对我国Asia 1型FMD的防制发挥巨大作用。本项目拟对ZB/CHA/58株在乳兔体内连续传代致弱的基因组变异、祖代强毒株和致弱毒株毒力的差异以及强毒株和弱毒株免疫原性的差异进行检测和分析，寻找决定病毒强毒株和弱毒株特性的主要因素及其分子生物学基础。在ZB/CHA/58株感染性克隆分子基础上，针对几个重要的基因片段进行替换和/或一些重要变异点进行突变，构建一系列重要基因片段替换或特定位点变异的系列重组病毒用于验证上述分析结果，寻找导致病毒在乳兔体内传代致弱的关键基因决定子，从一定程度上阐明ZB/CHA/58株病毒传代致弱的分子机理,为Asia 1型FMD疫苗种毒分子构建提供依据，有效地促进FMD疫苗研究。

为了明确亚洲1型口蹄疫病毒（FMDV）兔化弱毒ZB株传代致弱的分子基础，我们首先测定了ZB株亲本牛源强毒（ZBCF22）和传代致弱后的第168代(ZBRF168)、第188代(ZBRF188)的全基因序列，并与第187代兔化弱毒细胞适应株（ZB/CHA/58(att)）进行了比较分析，结果发现强毒株与弱毒株基因组发生了一系列明确的点突变，在非编码区中，5'-UTR中存在1个碱基突变，3'-UTR中存在1个碱基突变；在蛋白编码区中存在28个共同的氨基酸变异位点，其中VP1和3A蛋白编码区变异最大，其次是2BC、L和3D蛋白编码区，而VP4、VP2和3B蛋白未发生变化。这些点突变是ZB株致弱的分子基础。为了探索3A蛋白改变对病毒毒力的影响，我们对兔化弱毒ZB株3A蛋白中第127位氨基酸进行点突变后转染BHK-21，获得拯救病毒（rZB-3AΔR127），与亲本野生型的拯救病毒（rZBatt)比较，发现rZB-3AΔR127和亲本毒蚀斑形态存在轻微差异，病毒生成曲线和RNA复制能力测定表明R127突变病毒在BHK-21细胞中复制能力下降显著（P<0.01）；R127突变病毒对乳鼠致病力下降。结果提示了兔化弱毒ZB株中3A蛋白的127位精氨酸突变对病毒体外复制效率和乳鼠体内的致病性改变发挥作用。进一步，以兔化弱毒感染性cDNA为骨架，用牛源强毒株3A片段替换弱毒3A片段，体外拯救获得嵌合病毒（rZBΔ3A）。在病毒感染的BHK-21细胞和犊牛原代甲状腺细胞中，比较rZBΔ3A与rZBatt的病毒感染性、免疫反应性和病毒复制效率，结果表明二者显著差异，牛体内初步实验试验表明rZBΔ3A可导致FMD临床症状，而rZBatt感染观察不到明显的临床症状。结果提示ZB株在乳鼠体内传代致弱过程中3A变异是导致病毒毒力改变的主要决定因素。本项目明确了ZB株在乳兔体内传代致弱的分子基础, 证明了ZB株非结构蛋白3A是病毒的一个重要的毒力因子，可以为进一步深入研究FMDV毒力变异提供依据，有效地促进FMD疫苗研究。