施氏假单胞菌JP1厌氧降解多环芳烃机制的研究

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are harmful persistent organic pollutants, while the High-Molecular-Weight (HMW) PAHs are even more detrimental to the environment and human health. However, microbial anaerobic degradation of HMW PAHs has rarely been reported. PAHs are removed primarily through volatilization, photodegradation, settlement, bioaccumulation, chemical oxidation and microbial degradation. Among these, microbial degradation is the most thorough, least harmful PAHs removal method. However, little attention has been paid to the degradation mechanism under anaerobic conditions. This project with high polymer PAHs as the research object, by using the results of previous isolated facultative anaerobic microorganisms--Pseudomonas stutzeri JP1. In preliminary already described the foundation of polymer PAHs metabolic pathway, the use of new techniques and methods continue to dig metabolites have been obtained; in the basis of genome and transcriptome data, to explore the role of CoA ligase in PAHs anaerobic metabolism; effect of related gene in the anaerobic metabolism of PAHs, finally makes the key gene of metabolites and degradation pathways of mutual verification center.The present study will facilitate our understanding of the molecular mechanism underlying PAHs degradation, and promote microbial environmental remediation of PAHs in the future.

多环芳烃（PAHs）是一类强烈的的致癌物，严重危害环境和人类健康。利用微生物修复环境的PAHs污染具有高效、经济、无二次污染等优势，目前对PAHs的生物修复主要集中在有氧微生物。在沉积物等缺氧环境中存在大量PAHs污染，由于降解难度大，对其研究较少，对于高环PAHs的微生物厌氧代谢机制、代谢通路的研究几乎没有报道。本项目以高环PAHs为研究对象，利用前期分离得到兼性厌氧微生物——施氏假单胞菌JP1的成果，在已初步描述高环PAHs代谢通路的基础上，利用新的技术手段和方法继续深入挖掘代谢产物；在获得基因组和转录组数据的基础上，探索CoA连接酶等在PAHs厌氧代谢的作用；研究相关基因在厌氧代谢PAHs中的作用，最终把代谢产物和降解中心途径的关键基因相互印证。研究结果可充分挖掘微生物厌氧代谢PAHs功能基因资源，丰富微生物厌氧代谢PAHs的理论，为厌氧环境的PAHs污染修复奠定基础。

本研究通过一系列生理生化试验，发现菌株JP1为革兰氏阴性菌，能够产生过氧化氢酶，具有较好的耐盐性，在有氧和厌氧的条件下均能生长。菌株JP1对氯霉素和链霉素具有抗性；菌株JP1对抗生素羧苄青霉素敏感。.研究发现菌株JP1在有氧和厌氧条件下均可以利用多种多环芳烃作为唯一碳源和能源生长。有氧条件下，培养24 h，菌株JP1对终浓度20 mg/L的萘、菲、芘的降解率分别是92.89%、50.83%、42.50%；厌氧条件下，培养24 h，菌株JP1对终浓度20 mg/L的萘、菲、芘的降解率分别是95.26%、33.23%、37.35%。.本研究利用RNA-Seq技术，对菌株JP1在不同培养条件下的样本进行转录组分析。经测序获得的总读长（Total Reads）为110,468,508 bp，总核酸（Total Nucleotides）为12,929,366,300 nt，利用软件Trinity做转录组从头组装，组装得到3900个基因，G+C含量为64.61%，共注释到3820个基因，基因的平均长度为899.43 bp。对不同处理样本的差异表达基因进行分析以及GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析，发现大量与多环芳烃降解相关的基因，其中包括甲基巴豆酰基-CoA羧化酶和乙醇脱氢酶，这两个酶在萘、菲、芘的诱导下均呈现上调表达。利用RT-qPCR验证甲基巴豆酰基-CoA羧化酶α、β、γ亚单位分别上调表达2.85、5.74和1.26倍。说明甲基巴豆酰基-CoA羧化酶参与厌氧条件下多环芳烃的降解。.为了进一步研究菌株JP1厌氧条件下多环芳烃降解相关蛋白，本研究利用二维电泳技术分离多环芳烃菲诱导下的差异蛋白。利用软件PDQuest 8.0分析差异点，从中筛选6个差异显著的蛋白点，用MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定差异蛋白，鉴定结果为：超氧化物歧化酶、3-α-甲醇胺脱水酶、醌蛋白乙醇脱氢酶和ABC转运绑定蛋白，还有一个延伸因子和一个假定蛋白。用RT-qPCR验证醌蛋白乙醇脱氢酶在菲的诱导下上调表达3.16倍，进一步证实其参与多环芳烃的厌氧降解。.通过上述研究，初步解析了菌株生理生化特性及其对不同多环芳烃的降解效果；从转录和蛋白质水平初步探索了其在厌氧条件下降解多环芳烃的机制。本研究将对利用功能微生物进行多环芳烃污染环境的治理提供理论依据和技术支持。