顺式编码反义RNA PdrA在细菌叶酸代谢及盐胁迫反应中的调控功能

由细菌染色体产生的顺式编码反义RNA是细菌非编码RNA家族的重要成员。与反式编码反义RNA相比，有关此类RNA转录调控、稳定性、胞内互作因子和作用分子机制的研究非常初步。我们在野油菜黄单胞菌中发现了一个与叶酸代谢基因表达和耐盐胁迫反应相关的顺式编码反义RNA PdrA。PdrA RNA由操纵子sreS-hppK-pdrA转录，其靶基因可能为同一基因座位上的pdr1（编码喋啶还原酶）。本项目拟阐明PdrA RNA自身转录的调节过程，以及其调控靶基因表达的分子机制。研究内容包括确定PdrA RNA的转录启始及终止位点；分析PdrA RNA的基本转录模式及与杂合组氨酸激酶SreS蛋白磷酸化的关系。在此基础上，深入分析PdrA RNA的二级结构及其调控pdr1基因表达的分子机制；阐明pdrA/pdr1转录平衡对叶酸代谢和细菌耐盐性的影响。研究结果将对我们理解细菌非编码RNA的调控功能提供新的实例

本项目解析了野油菜黄单胞菌中，一个包含顺式编码反义RNA PdrA在内的复杂操纵子基因表达调控的分子机制。该操纵子由SreK-SreR-SreS-HPPK-PdrA的编码基因组成。其中，阶段性成果集中阐明了杂合组氨酸激酶SreS调控整个操纵子，包括PdrA激增式表达（expression surge）的分子调控机理和生化机制。SreS的结构域比较独特和复杂，包含1个N端的receiver结构域（REC1），1个C端的receiver结构域（REC2），和1个位于中间的transmitter结构域。sreS突变后显著影响细菌的耐胁迫能力，并且正反馈调控了该操纵子中各基因的转录。在这个正反馈调控通路里，SreS通过调控该操纵子的两个串联启动子中的P2启动子，特异性地调控远3ˊ端hppK及pdrA的激增式转录。利于亲合蛋白质组学方法，筛选并鉴定到了在盐胁迫条件下能够作为转录协同激活子的反应调节蛋白SreR。通过体外磷酸基团传递实验，证明SreK-SreR是一个TCSTS。虽然SreS并不直接磷酸化SreR，但SreS蛋白N端的receiver域能够与反应调节蛋白SreR竞争来自于SreK-P的磷酸基团，从而间接抑制SreK向其配对的、单结构域反应调节蛋白SreR传递磷酸基团。因此，SreS是SreR的磷酸沉降物（phosphate sink），能够使SreK-SreR TCSTS脱磷酸化。ChIP-qPCR分析表明非磷酸化状态的SreR是其激活状态，具有更强的结合并激活P2启动子，启动激增式转录，而HPPK-PdrA的激增式表达对于细菌在盐胁迫条件下的适应性和生存繁殖是至关重要的。综上所述，本研究解析了一个由SreK-SreR-SreS构成的“三组分”信号转导系统，通过调控反应调节蛋白SreR的磷酸化水平来精细调控下游基因及顺式编码反义RNA激增式表达的生化机制。这是首次发现杂合组氨酸激酶的信号接收结构域也能作为磷酸沉降物调控反应调节蛋白的磷酸化水平，证明了多结构域的杂合组氨酸激酶具有除感应信号以外的其它调控功能。受本项目资助，研究团队已经在微生物学和分子植物病理学主流期刊EMI, MPMI和JGG上发表原始研究论文4篇。培养博士、硕士研究生4名，其中1名已获博士学位，完成了任务书预期的全部考核指标。其余研究成果正在整理，发表后将及时报送后续成果。