柑橘2n雌配子有性群体创制及着丝粒遗传定位

In the absence of knowledge of centromere position, it is a laborious and time consuming work to determine the mechanism driving the formation of 2n gametes through estimation of parental heterozygosity restitution using a larger progeny population and lots of markers. However, recombination between homologs occurs rarely during the meiosis. Exploring molecular markers closely related to the centromeres is essential to help uncover the mechanism underlying 2n gamete formation efficiently. However, knowledge of centromere position in genetic map is the precondition for conducting above researches. In this proposal, based on our previous work, we plan to (i) produce triploid and tetraploid hybrids arising from the 2n megagametophytes through sexual hybridization using Murcott tangor as female parent with diploid and autotetraploid Ponkan mandarin as male parents; (ii) re-sequence the Murcott tangor, diploid and autotetraploid Ponkan mandarin to explore chromosome specific and polymorphic SNP markers and to genotype the triploid and tetraploid hybrids; (iii) map the genetic and physical position of centromeres by constructing a high-density ‘SNP-centromere’ genetic map. The implementation of this proposal will provide not only an efficient method for analyzing the mechanism of 2n gamete formation, but also produce some new materials that can be used in citrus seedless breeding.

2n配子在柑橘多倍体创制和无核育种中具有重要利用价值。减数分裂前期由于同源染色体存在交叉互换，在着丝粒位置未知情况下，2n配子遗传机制分析需基于较大的遗传群体和分子标记数量，费时费力。但着丝粒附近极少发生交换，筛选近着丝粒标记是快速准确分析2n配子遗传机制的有效途径，而着丝粒遗传定位是开展上述研究的重要前提。基于申请人前期研究基础，本项目拟以极易产生2n雌配子的‘默科特’橘橙为母本与椪柑二倍体及其同源四倍体分别有性杂交，以期培育由母本2n雌配子受精形成的三倍体、四倍体有性后代；同时对‘默科特’橘橙、椪柑二倍体及其同源四倍体重测序，开发染色体特异的多态性SNP标记；基于对多倍体有性后代的基因分型和杂合性分析，构建高分辨率‘SNP-着丝粒’遗传图谱并定位着丝粒在染色体的物理位置。本项目前期基础扎实，其实施不仅可遗传定位柑橘着丝粒，具有理论意义；而且创制的材料可用于柑橘无核育种，具有应用前景。

2n配子在柑橘多倍体创制和无核育种中具有重要利用价值，其参与的有性多倍化是实现柑橘无核的重要手段。2n配子在柑橘育种中已取得良好进展，但其形成遗传机制研究却相对滞后，其原因是着丝粒位置未知情况下，采用常规分析方法需基于较大的遗传群体和分子标记数量，费时费力。项目负责人前期研究发现‘默科特’橘橙极易产生2n雌配子，其2n配子有性后代不仅可以应用于柑橘无核育种，而且是柑橘着丝粒定位的宝贵试材。本项目通过以‘默科特’橘橙为母本，椪柑同源四倍体为父本倍性杂交，创制了一批三倍体和四倍体新种质，为柑橘无核育种及着丝粒定位奠定了材料基础。进一步以‘默科特’橘橙2n雌配子受精形成的54株四倍体有性后代为试材，采用半四分体分析法和着丝粒组蛋白CenH3染色质免疫共沉淀法进行了柑橘着丝粒的物理位置。基于半四分体法，除4号染色体外，其余8条染色体均获得了着丝粒候选区域，大小介于1.12-18.19 Mb之间；而基于CenH3染色质免疫共沉淀法定位的着丝粒候选区域大小介于0.01-7.60 Mb之间。将上述2种方法定位的着丝粒候选区域进行比较，发现用2种方法定位的着丝粒候选区域邻近或部分重叠；且从着丝粒候选区域筛选重复序列设计探针进行染色体荧光原位杂交，9条重复序列可在多数染色体主缢痕处有产生荧光信号，验证了本项目着丝粒定位的准确性。此外，基于以上结果，本项目还开发了13个近着丝粒SNP分子标记用于‘尤力克’柠檬2n雌配子遗传机制分析。本项目的实施不仅获得了一批柑橘多倍体新种质用于无核育种，且定位了柑橘着丝粒并开发近着丝粒分子标记应用于柑橘2n配子遗传机制分析，完成了项目目标。已在Plant Cell Reports等杂志发表SCI论文3篇。