自噬与凋亡互调节作用在苗药都木油抗MIRI中的分子机制研究

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）在冠心病急性心肌缺血事件中的主要病理表现是缺血缺氧导致的细胞损伤。最新研究表明：自噬对MIRI起"双刃剑"作用，Beclin 1和mTOR介导的细胞自噬/凋亡互调节可能是调控自噬双向作用转向促细胞存活的重要机制。我们前期研究证实苗药都木油单体成分荭草苷的抗心肌缺血作用可能与抗凋亡和诱导自噬有关。在此基础上，本项目拟复制大鼠离体心脏缺血再灌注模型和原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型，采用电镜、激光共聚焦、流式细胞仪、免疫共沉淀、Real Time-PCR、Western blot等技术，研究Beclin1与mTOR信号通路在自噬/凋亡中的调节作用，探寻荭草苷防治MIRI的主要作用靶点，验证"苗药都木油抗MIRI的核心是通过调节Beclin1与mTOR双通路，诱导细胞适度自噬，促使自噬"双刃剑"作用转向细胞保护"的假说，为都木油防治MIRI提供药理学依据。

细胞自噬，一种细胞内源性保护机制，与心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）的发生发展密切相关，目前已成为MIRI新的治疗靶点。荭草苷（Orientin）属黄酮类单体成分，是苗药都木油的主要药效物质基础之一，具有抗氧化、抗凋亡等作用。本项目首先通过建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注模型（缺血30 min，再灌注120 min），采用电镜、荧光显微镜、Western blot等方法，在动物水平研究荭草苷对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用以及与自噬和凋亡的关系。动物实验结果表明：荭草苷对大鼠心脏缺血再灌注损伤具有明显保护作用，而且初步判定其保护机制可能与降低心肌细胞凋亡及增强细胞自噬有关。在此基础上，本项目又利用三气培养法建立大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型（缺氧 12 h，复氧 12 h），采用电镜、激光共聚焦、流式细胞仪、免疫共沉淀、Western Blot等技术，研究mTOR与Beclin 1双通路在细胞自噬与凋亡中的调节作用，探寻荭草苷诱导细胞适度自噬的分子机制。细胞实验结果表明：荭草苷可通过AMPK-mTORC1信号通路激活心肌细胞自噬发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用；还可通过抑制Bcl-2和Bcl-XL磷酸化而增强内质网上Beclin 1与Bcl-2的结合程度而阻止Beclin 1介导的心肌细胞过度自噬；此外，荭草苷对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用可能与激活PI3K-Akt信号通路有关，其可能的保护机制之一是通过活化Akt而磷酸化Beclin 1 的Ser234位点，进而阻止Beclin 1介导的心肌细胞过度自噬。以上实验结果验证了“荭草苷抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的核心是通过调节mTOR与Beclin 1双通路，诱导细胞适度自噬，促使自噬“双刃剑”作用转向细胞保护”的假说，为苗药都木油防治MIRI提供药理学依据。