利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-小型猪动脉粥样硬化模型

Cardiovascular and cerebrovascular diseases, a leading cause of mortality worldwide, are caused mainly by atherosclerosis, a chronic inflammatory disease of the arterial wall. The underlying pathogenesis of atherosclerosis remains elusive, however, hyperlipidemia and hypercholesterolemia are considered as the most important risk factors of atherosclerosis. Apolipoprotein E (ApoE) plays an important role in cholesterol and lipoprotein transport and metabolism. Although ApoE knockout mice have been used as model of atherosclerosis and led to an understanding the mechanisms of atherosclerosis development, it is not a suitable model for human atherosclerosis development. Production of genetically engineered pig models has several advantages over rodent models due to its similar coronary anatomy and physiology to the humans. ApoE-/- pig has yet been reported. In this study, highly efficient CRISPR/Cas9 system will be used to target and disrupt ApoE gene in Zhonghua Miniature pigs followed by somatic cell nuclear transfer to produce the first ApoE-/- pigs in the world. The ApoE-/- pigs could be useful models for providing further insight into pathogenesis of atherosclerosis and clues to assess novel prevention and treatment applications.

心脑血管疾病是全世界主要的致死性疾病，动脉粥样硬化是其重要的病理基础。高脂血症和高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化发病及发展的重要因素。载脂蛋白E (ApoE)在胆固醇和脂蛋白的转运和代谢中发挥重要作用。ApoE基因敲除小鼠的广泛应用，使得动脉粥样硬化早期病理机制的研究取得了很大进展。但ApoE敲除小鼠与人类在动脉粥样硬化病理机制上相去甚远。小型猪因为在解剖学和生理上和人类似，适合于建立动脉粥样硬化大动物模型。但ApoE基因敲除猪还没有被报道。本项目以中华小型猪为材料，拟通过CRISPR/Cas9技术制备ApoE基因敲除细胞系，再通过体细胞核移植，建立国际上首例 ApoE基因敲除猪，作为研究动脉粥样硬化的大动物模型。该模型的建立将更有效地研究人类动脉粥样硬化的发病机制，并为评估新的防治策略提供可靠的大动物模型。

随着心血管疾病发病率逐年升高，作为心脑血管疾病基础病因的动脉粥样硬化也受到广泛关注。动脉粥样硬化初期动脉血管壁内膜及内膜下脂质及糖类异常聚集，血管内皮隆起形成粥样病灶或纤维性脂质病变，造成血管管壁变厚，管腔狭窄。随着病程进展，动脉粥样硬化斑块会发生破裂，破裂后的斑块脱落，随血流进入循环，在管腔狭窄处形成血栓，阻塞血液流动。载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）是脂代谢中一个重要的蛋白，ApoE功能缺失会导致脂代谢紊乱，从而加速动脉粥样硬化发病进程。许多科学家使用ApoE转基因小鼠作为动物模型进行动脉粥样硬化研究，但ApoE敲除小鼠并不能很好的模拟人类动脉粥样硬化的病因及病程，因此建立一个合适的动脉粥样硬化模型对于动脉粥样硬化的研究至关重要。小型猪在模拟动脉粥样硬化方面具有优于啮齿动物的优势，因为它们的心血管系统和生理学与人类相似。为了建立家族性高胆固醇血症和动脉粥样硬化的改良大型动物模型，我们使用了CRISPR / Cas9系统敲除了巴马小型猪的ApoE基因。同时生产双等位基因修饰的具有框内突变（ApoEm/m）和移码突变（ApoE-/-）的ApoE基因敲除猪。常规饲料饲养时，ApoE-/-猪血浆胆固醇水平适度增加，而使用高脂和高胆固醇（HFHC）饲料喂养的猪表现出严重的高胆固醇血症，并在使用高脂饲料喂养六个月后主动脉和冠状动脉中都形成了动脉粥样硬化病变。本研究首次利用ApoE基因敲除巴马猪通过高脂饲养诱导建立动脉粥样硬化模型，为研究其发病机制，检测各类血管内支架以及验证药物的作用及机制提供良好的大动物试验模型。