革兰阴性菌中合成Kdo2-Lipid A的蛋白质反应机理研究及抑制剂筛选

Lipid A which is the key component of lipopolysaccharide (LPS) and serves as an outer membrane anchor is an essential factor for the survival of Gram-negative bacteria, and responsible for major bioactivity of endotoxin. Lipid A biosynthesis requires nine enzymes which can be the potential agent targets for the new drug discovery since they are different targets with that of the current antibacterial agents. Therefore the study on the Lipid A biosynthetic enzymes in the molecular level is the important topic in the field of medical and biological science. This project focus on three Lipid A biosynthetic enzymes (LpxC, LpxH and LpxB), which are located closed to membrane or inner membrane. We will reveal the substrate recognition and reaction mechanisms of LpxH and LpxB by crystal structure analysis in the apo form and the complex with substrate or product. Furthermore, we will search active compounds which are able to inhibit the Lipid A biosynthesis of LpxC, LpxH and LpxB, from natural product/drug of herbal medicine for discovering lead/hint ligands of new antibacterial agents.

Kdo2-Lipid A(Lipid A)是革兰阴性菌脂多糖LPS的关键活性成分，具有将脂多糖固定在外膜外表面的锚定作用，不仅是革兰阴性菌内毒素的活性实体，同时也是革兰阴性菌生存的必需因子，抑制合成Lipid A蛋白质组的活性会导致革兰阴性菌死亡。由于这些蛋白质与现有革兰阴性菌抗菌剂的作用靶点完全不同，将会成为新型抗菌剂开发的突破点。本申请，以合成Lipid A的蛋白质组中未知的，膜表面存在的LpxH、LpxB及因基质较小而成为抗菌剂开发重点的LpxC为研究对象，X射线结晶结构分析作为主要研究手段，阐明这些蛋白质的基质识别及合成反应作用机理。并基于所得到的3种蛋白质及蛋白质与基质/产物复合体的立体结构，从天然药物有效活性成分中筛选和寻找LpxC、LpxH、LpxB的抑制剂，为新型抗革兰阴性菌药物开发提供先导化合物。

Kdo2-lipid A(Lipid A)是革兰阴性菌脂多糖LPS的关键活性成分，具有将脂多糖固定在外膜外表面的锚定作用，不仅是革兰阴性菌内毒素的活性实体，同时也是革兰阴性菌生存的必需因子，抑制合成Lipid A蛋白质组的活性会导致革兰阴性菌死亡。由于这些蛋白质与现有革兰阴性菌抗菌剂的作用靶点完全不同，对于合成Lipid A蛋白质组的研究将会成为新型抗菌剂开发的突破点。本申请，以合成Lipid A的蛋白质组中未知的，膜表面存在的LpxH、LpxB及因基质较小而成为抗菌剂开发重点的LpxC为研究对象，X射线结晶结构分析作为主要研究手段，阐明这些蛋白质的基质识别及合成反应作用机理。并基于立体结构，从天然药物有效活性成分中筛选和寻找LpxC、LpxH、LpxB的抑制剂，为新型抗革兰阴性菌药物开发提供先导化合物。. 本课题研究期间，我们主要是首次解析出LpxH的立体结构，并根据结构提出反应作用机理。首先，我们解析出LpxH与产物的复合体（EP）的立体结构，并根据EP结构，设计了变异体H10N，成功的解析出LpxH的立体结构的（E, Apo-form）（Scientific Reports, 2016）。LpxH的立体结构表明：LpxH是由催化功能域和底物/产物结合功能域组成。根据催化功能域的结构比较，断定LpxH的催化反应机理和Metallo-phosphodiesterases的是相似的。LpxH的底物/产物结合功能域是α-helix结构，主要识别底物/产物UDP-2,3-diacylglucosamine的2-Chain。而且，区域S160-A168在无底物/产物结合的时，处于disorder的不稳定状态，LpxH为开放型； 而底物/产物的结合导致了该区域的结构形成，并使LpxH呈现为闭合状态。另外再加上LpxB与LpxH，LpxB与LpxH-H10N的共表达实验，我们提出了LpxH的反应作用机理，以及与LpxB之间传递合成物的模式。同时，为寻找LipidA的合成抑制剂，我们从天然药物有效活性成分中进行了对革兰阴性菌有抗菌作用的成分的筛选和寻找。确定没食子酸可为抑制剂的候选。在本课题研究期间，发表的相关论文SCIE检索4篇，国内期刊1篇。培养硕士生1名，在读博士生1名。