点击化学可控制备含氟超支化聚磺酸酯及其基因转染应用研究

Gene vectors with low toxicity and high gene transfection efficiency are the main development direction of clinical gene therapy. Fluorinated hyperbranched polysulfates (FHn-PSu) with degradable, high DNA-binding affinity, low toxicity and high gene transfection efficiency will be prepared by sulfur(VI) fluoride exchange (SuFEx) click chemistry and thiol-ene click reaction. Fluoride modification can improve the DNA-binding affinity of FHn-PSu, decreasing the optimal nitrogen and phosphorus ratio and cytotoxicity, and improving the gene transfection efficiency. The degree of branching (DB) of FHn-PSu can be controlled by the ratio of branching to linear monomer. The structure, DB and molecular weight of FHn-PSu will be characterized by NMR, GPC, MALDI-TOF MS etc. The effects of DB and fluorine amount of FHn-PSu on DNA-binding affinity, stability and efficiency of releasing entrapped DNA from FHn-PSu/DNA polyplexes were studied. Through this research, a general approach to the synthesis of FHn-PSu with controllable DB and fluorine amount will be obtained, and the relationship between structure of FHn-PSu (DB and fluorine amount) and gene transfection efficiency would be elucidated. The gene vectors with high DNA-binding affinity, low toxicity and high gene transfection efficiency would be obtained, which lays the foundation for the application of FHn-PSu in biomedicine and crop pest control.

安全低毒、高基因转染效率的基因载体是临床基因治疗的主要发展方向，本项目拟利用磺酰氟点击化学和硫醇-烯烃点击化学反应制备支化度可控的具有可降解、安全低毒、高DNA亲和性、高效基因转染效率的含氟超支化聚磺酸酯(FHn-PSu)。氟化修饰能够提高FHn-PSu与DNA的亲和力，降低FHn-PSu的最佳转染氮磷比和细胞毒性，同时提高基因转染效率。拟通过线性单体和支化单体的比例控制支化度，利用NMR、GPC、MS等表征化合物的结构、支化度、分子量等。研究FHn-PSu/DNA复合物的亲和性、稳定性、DNA的释放性能，以及研究FHn-PSu的支化度和氟含量对细胞毒性、基因转染效率的影响规律。获得氟含量和支化度可控制备FHn-PSu的技术，以及2-3个高DNA亲和性、安全低毒、高基因转染效率的基因载体，为FHn-PSu在生物医药和农业害虫预防等领域的应用提供规律性认识和实验指导。

安全低毒、高基因转染效率的基因载体是临床基因治疗和农业害虫预防的发展方向，本项目利用磺酰氟点击化学和迈克尔加成反应等制备了含氟超支化聚磺酸酯和含氟树形聚磺酰胺（HPAA-4FBAn系列、HPAA-5F系列、HPAA-7F系列和PAMAM-7F系列），并利用红外光谱（FT-IR）、核磁氢谱（1H NMR）、凝胶渗透色谱（GPC）和茚三酮反应法确定了HPAA-4FBAn系列、HPAA-5F系列、HPAA-7F系列和PAMAM-7F系列的微观结构（含氟基团、氟含量、磺酸酯、磺酰胺结构）。系统深入研究了微观结构对树形聚合物基因载体的细胞毒性、细胞摄取和基因转染效率的影响规律。主要内容包括：（1）含氟超支化聚磺酸酯（HPAA- 4FBAn）的制备及基因转染研究；（2）含氟超支化聚磺酸酯（HPAA-5F）的制备及基因转染研究；（3）含氟树枝状聚磺酰胺（PAMAM-7F）的制备及细胞毒性、细胞摄取和基因转染研究；（4）含氟超支化聚磺酰胺（HPAA-7F）的制备及细胞毒性、细胞摄取和基因转染研究；（5）利用筛选出来的基因载体携带基因干扰进行害虫防治活体水平实验研究。氟化修饰能够提高载体与DNA的亲和力，降低载体的最佳转染氮磷比和细胞毒性，同时提高基因转染效率。细胞实验表明：HPAA-7F系列和PAMAM-7F系列载体安全低毒，都能够携带基因（DNA或dsRNA）快速进入草地贪夜蛾Sf9靶细胞，且随着七氟含量的增加，HPAA-7F系列和PAMAM-7F系列载体穿透细胞膜及运载基因的能力增强，其中，PAMAM-7F28和HPAA_7F*18具有更加高效、安全低毒的基因转染效率。活体实验表明：PAMAM-7F28和HPAA_7F*18载体能够携带dsRNA快速进入活体昆虫体内细胞中，抑制害虫发育。研究表明PAMAM-7F28和HPAA_7F*18是一种很好的基因载体和基因干扰载体，为载体在生物医药和农业害虫预防等领域的应用提供规律性认识和实验指导。