半胱氨酸蛋白酶在花药绒毡层细胞程序化死亡中的功能和分子机理研究

Based on our previous studies on the anther development in rice funded by NSFC, this project will focus on the molecular mechanisms of tapetum programmed cell death (PCD) in the regulation of pollen fertility in rice. TDR and its Arabidopsis ortholog AMS play important roles in anther development in rice and Arabidopsis, respectively. By in-depth analyzing the transcriptomic data of mutants of TDR and AMS, and combining with gene co-expression analysis and tobacco-yeast transformation, the putative executor of anther tapetum PCD, cysteine proteases, will be screened and identified from downstream targeted genes of TDR/AMS in this project. To explore the genetic and biochemical functions of the key cysteine proteases in anther development and tapetum PCD, further genetic analysis on relevant mutants and caspase-like activity analysis will be performed in this project. On one hand, the present project hope to provide a theoretical basis for exploring the mechanism of pollen fertility modulation and its application to practical breeding by uncovering the functions of cysteine proteases/genes in anther development and tapetum PCD in plant. On the other hand, this project hope to explore the regulatory differences between animal PCD and plant PCD from a biochemical and molecular evolutionary respective by both in vivo and in vitro biochemical characterizing the caspase-like activities of these cysteine proteases.

本项目将在前期对水稻/拟南芥花药发育过程有较好的遗传和分子研究的基础上，进一步重点开展花药绒毡层细胞程序化死亡（PCD）调控花粉育性的分子机理研究。本项目拟通过研究水稻和拟南芥中控制花药绒毡层降解的一对同源转录因子TDR/AMS突变体的表达谱芯片、共表达网络和烟草酵母转化实验，来筛选和鉴定TDR/AMS调控下游靶标中可能执行绒毡层PCD过程的半胱氨酸蛋白酶/基因，以及进一步通过对候选基因的突变体的遗传学和体内/体外的类caspase酶活性分析，来揭示这些关键蛋白酶/基因在植物花药发育和绒毡层降解过程中的遗传学和生化功能；本项目一方面期望通过研究半胱氨酸蛋白/基因在绒毡层PCD中的遗传调控分子机理，为花粉育性的调控机制和在育种中的应用提供理论基础；另一方面，期望通过分析半胱氨酸蛋白酶在植物体内和体外的生化功能（类caspase酶活），从蛋白分子水平和进化角度探索动物和植物细胞PCD的差异。

细胞程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD）是指细胞在一定的生理或病理条件下, 为了维持内环境稳定并更好地适应生存环境而采取的一种由基因控制的、细胞主动且有序的死亡。动物细胞PCD过程实际上是caspase（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）不可逆有限水解底物的级联放大反应过程；但植物基因中不存在动物PCD过程中的caspase酶/基因。开花植物的花药最内层的绒毡层细胞适时的PCD降解，对花药的发育和花粉的形成有重要的生物学意义。本项目在前期对水稻/拟南芥花药发育过程有较好的遗传和分子研究的基础上，重点开展花药绒毡层细胞程序化死亡（PCD）调控花粉育性的分子机理研究。主要通过研究水稻和拟南芥中控制花药绒毡层降解的一对同源转录因子TDR/AMS突变体的表达谱芯片、共表达网络和烟草酵母转化实验，筛选和鉴定TDR/AMS调控下游靶标中可能执行绒毡层PCD过程的5个半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶/基因（CYS11、ASP39、ASP47、ASP51和ASP52），并进一步通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，获得这些基因的单突变体/和多突变体，并开展相关的遗传学分析，证明了这些基因的在花药绒毡层中特异性表达、可以导致花粉绒毡层降解异常、以及与关键转录因子TDR/AMS之间的表达调控关系，以及体内/体外的酶活性分析，初步揭示这些关键蛋白酶/基因在植物花药发育和绒毡层降解过程中的遗传学和生化功能。本项目通过研究半胱氨酸/天冬氨酸蛋白在绒毡层PCD中的遗传调控分子机理，为花粉育性的调控机制和在育种中的应用提供理论基础，以及从蛋白分子水平和进化角度探索动物和植物细胞PCD的差异。本项目执行期内发表本项目资助的研究论文5篇。2018年获得教育部一等奖1项（项目名称：植物花药绒毡层细胞死亡和花粉外壁建成的分子机制）。