小麦非生物胁迫相关MYB转录因子TaSIM的功能及分子机理研究

MYB transcription factors play pivotal roles in the abiotic stress response in plants, but their functions and underlying mechanism in wheat (Triticum aestivum L.) have not been fully investigated. In a previous work, a salt-induced MYB gene, TaSIM, which encodes a R2R3-type MYB transcription factor was identified in wheat. The TaSIM protein was localized to the nucleus where it activated transcription. In this study, real-time PCR was used to analyze expression profiles and stress-responsive expression patterns of TaSIM; Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) and yeast-one-hybrid systems were used to determine whether the TaSIM protein can bind to these MBS-containing probes; To evaluate the role of TaSIM in tolerance to abiotic stress, this study generated transgenic plants with overexpression TaSIM and characterized its biological role by phenotypic and physiological analyses in transgenic plants; Furthermore, microarray and proteomic analysis were used to detect differences between gene expression and proteomes profiles of wild-type and transgenic plants. These results are helpful in understanding the mechanisms of plant responses to abiotic stresses and provide us with candidate genes that may facilitate the improvement of the stress tolerance of crops through molecular breeding.

MYB转录因子在植物非生物胁迫应答中具有重要的作用，但是小麦MYB转录因子的功能和作用机制仍需深入研究。本项目前期研究发现小麦TaSIM基因，编码一个R2R3-MYB转录因子，具有转录激活活性，定位于细胞核，受高盐诱导表达。本项目拟在现有的工作基础上，对小麦TaSIM基因的功能及分子机理进行深入研究。主要包括：通过实时定量PCR方法分析TaSIM基因在多种胁迫下和不同小麦组织中的表达模式；通过酵母单杂交和凝胶阻滞系统分析TaSIM蛋白结合顺式作用元件DNA序列的结合特异性；通过基因过量表达技术获得转基因拟南芥植株，进而通过逆境胁迫下的表型鉴定和生理分析等技术了解TaSIM的生物学功能；并进一步应用基因芯片分析技术和蛋白质组分析技术，在基因和蛋白水平比较转基因植株和非转化植株之间基因和蛋白表达的差异，从而阐明TaSIM基因在植物抗逆境胁迫中的调控机制，为小麦抗逆分子育种提供理论依据。

小麦是全球主要的粮食作物，干旱和高盐是两个主要的非生物胁迫，严重影响小麦的生长发育和产量。解析小麦对非生物胁迫的应答，耐受性和适应性机制，对培育小麦胁迫耐受品种至关重要。R2R3-MYB转录因子在调控对多种非生物胁迫的耐受性中起重要作用。本研究分析了小麦TaSIM基因在干旱和高盐胁迫中的生物学功能，主要研究结果如下：实时定量RT-PCR检测表明，TaSIM基因在不同组织中均有表达，在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。TaSIM基因受干旱、高盐、低温和ABA诱导表达。酵母单杂交实验表明TaSIM转录因子能够特异结合MYB结合位点II基序。TaSIM重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃诱导2h。重组蛋白以可溶形式高效表达，用蛋白标签亲和层析柱（His TrapTM HP）获得纯化重组蛋白，Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应。过表达TaSIM转基因拟南芥相比野生型（WT）减少叶片失水率，增强抗旱能力。在盐胁迫下，35S:TaSIM拟南芥植物相比WT表现出更高的存活率和更长的根。而且，干旱和盐胁迫相关的生理指标测定结果表明, 35S:TaSIM转基因植物与WT相比脯氨酸含量和可溶性糖含量增加。微阵列结果表明，在正常生长条件下，35S:TaSIM转基因株系相比WT植株有128个基因具有统计学意义的表达变化，在35S:TaSIM转基因株系中31个基因表达变化在2倍以上，其中18个基因上调表达，13个基因下调表达。大多数这些基因的功能与非生物胁迫应答相关。与微阵列数据一致，实时定量RT-PCR结果表明正常和胁迫条件下RD22和RD29A在35S:TaSIM植物中表达水平更高，表明在35S:TaSIM中逆境应答基因为组成型表达。采用蛋白质双向电泳技术，鉴定35S:TaSIM转基因株系与WT之间的差异表达蛋白。结果表明，在正常生长条件下，35S:TaSIM转基因株系相比WT植株有15个蛋白点表达变化超过2倍。通过MALDI-TOF-TOF/MS（二级质谱分析）鉴定表明这些蛋白参与细胞结构，新陈代谢，能量，蛋白命运，防卫/逆境应答和运输。以上这些结果表明TaSIM基因是1个干旱和高盐胁迫的正调控子，在作物抗旱耐盐分子育种中具有潜在的应用价值。