斑蝥素致肾毒性的生物标志物及毒理机制研究

Cantharidin(CTD) , a main active component of Mylabris with well-defined nephrotoxicity, which is widely used in Traditional Chinese Medicine, have been shown strong anti-cancer effects. However, the clinical uses of CTD are limited by its narrow therapeutic window and severe toxicity. The early warning and mechanism of nephrotoxicity of CTD-induced nephrotoxicity is not yet clear. Metabolomics can sensitively and accurately reflect physical conditions. Thus, it is well suited for to study the early metabolic markers and mechanism of CTD-induced nephrotoxicity. Based on the early research, in our present study, firstly, the metabolic profile and metabolic markers are explored by LC-MS/MS on the serum, urine and renal tissue induced by CTD. The early metabolic markers of CTD-induced nephrotoxicityare screened by prediction modeling based on classification trees and correlation regression analysis, et al. Secondly, the enzyme and protein targets are found in biologic signal pathway associated with metabolic markers by various databases, then, RT-PCR and Western blot are used for analysis the level on gene and protein expression. Finnally, integrating with the classic toxicity markers, the early metabolic markers of CTD-induced nephrotoxicity are further optimized by artificial neural network（ANN) and correlation regression analysis. And then, the integrated mechanism of CTD-induced nephrotoxicity is explained. This study has great scientific significance for revealing the early metabolic markers and mechanism of CTD-induced nephrotoxicity and provides new scientific basis for prevention, precaution and treatment.

斑蝥素是斑蝥抗肿瘤的主要活性成分，但其引起的肾毒性是限制其临床应用的主要原因之一，迄今斑蝥素早期肾毒性监测手段及毒理机制仍不明确。代谢组学能灵敏、准确地反映机体的整体状态，适合于斑蝥素致肾毒性的生物标志物及毒理机制研究。本项目拟在在前期研究的基础上，采用LC-MS/MS技术获取斑蝥素致大鼠肾毒性血清、尿液、肾脏动态代谢谱及代谢标志物，借助分类树等数学方法建立斑蝥素肾毒性预测模型，寻找早期代谢标志物，分析代谢标志物所在的代谢通路及其关联的上下游关键蛋白等靶点，并验证其基因和蛋白水平表达；关联剂量、时间和常规毒性指标，构建量-时-毒关系方程，采用数据挖掘优化斑蝥素致肾毒性的早期代谢标志物，并从生化代谢角度阐释斑蝥素致肾毒性的整合作用机制。本研究对于揭示斑蝥素致肾毒性的早期生物标志物和毒理机制具有重要意义，并为斑蝥素及斑蝥相关制剂致肾毒性的预防、早期预警及减毒策略提供新的科学依据。

斑蝥素是斑蝥抗肿瘤的主要活性成分，但其引起的肾毒性是限制其临床应用的主要原因之一，迄今斑蝥素早期肾毒性监测手段及毒理机制仍不明确。代谢组学能灵敏、准确地反映机体的整体状态，适合于斑蝥素致肾毒性的生物标志物及毒理机制研究。本项目拟在在前期研究的基础上，采用LC-MS/MS技术获取斑蝥素致大鼠肾毒性血清、尿液、肾脏动态代谢谱及代谢标志物，借助分类树等数学方法建立斑蝥素肾毒性预测模型，寻找早期代谢标志物，分析代谢标志物所在的代谢通路及其关联的上下游关键蛋白等靶点，并验证其基因和蛋白水平表达；关联剂量、时间和常规毒性指标，构建量-时-毒关系方程，采用数据挖掘优化斑蝥素致肾毒性的早期代谢标志物，并从生化代谢角度阐释斑蝥素致肾毒性的整合作用机制。研究结果发现6种尿液中代谢物，76个时序血液代谢标志物，20个肾脏代谢标志物，进一步代谢通路分析发现斑蝥素致大鼠肾毒性可能丙氨酸代谢、色氨酸代谢和甘油磷脂代谢3条通路紊乱。并基于血液代谢标志物采用随机森林算法建立了斑蝥素大鼠肾毒性预测模型，预测准确度为0.5850，AUC曲线下面积为0.8121，精确度为0.6186，表明本研究建立的CTD致大鼠肾毒性预测模型具有较好的预测能力，能够对CTD肾毒性的不同阶段进行初步的预测。查阅文献及 KEGG、PubChem、HMDB 数据库筛选出其关键代谢物油酰乙醇胺（N-Oleoylethanolamine, NOE）为关键功能代谢标志物，qPCR检测发现CTD给药于大鼠后，大鼠肾组织中的PLA2G1B 的转录组水平呈剂量依赖性上升，ENPP2 的转录组水平下降， NAPE-PLD 的转录组水平在 CTD 低、中剂量组上升，在 CTD 高剂量组下降。WB检测发现CTD给药于大鼠后，大鼠肾组织中的NAPE-PLD、PLA2G1B、ENPP2三个酶的表达水平呈剂量依赖性上升，提示其下游代谢物NOE在 CTD 致大鼠肾毒性模型中也呈上升趋势，这与代谢组学结果相符。本研究对于揭示斑蝥素致肾毒性的早期生物标志物和毒理机制具有重要意义，并为斑蝥素及斑蝥相关制剂致肾毒性的预防、早期预警及减毒策略提供新的科学依据。