尘螨exosomes通过Hsp70促进过敏性哮喘炎症反应作用机制研究

House dust mite is the main cause of allergic asthma. Identification of house dust mite allergy is the key point in the diagnosis and treatment of allergic asthma. In the previous work, we successfully constructed dust mite cell line and extracted exosomes from this cell. The exosome was proved aggravated the inflammatory response of asthma mice, and further found that Hsp70 expression in exosomes was higher than that in cells. Hsp70 is a newly named dermatophagoides allergens Derf28, which can regulate the DC cells by TLR/MyD88 and affect the differentiation of CD4+T cells in the immune response. When asthma occurs, the allergen is identified by DC recognition through the mucous membrane and stimulates the CD4+T cell immune response. Based on the above research, the hypothesis is put forward: house dust mite exosomes regulates DC cells through Hsp70/TLR/MyD88, influences initial CD4+T cell differentiation, and promoted allergic asthma in mice. The aim of this project is to demonstrate the mechanism of exosomes in asthma by overexpress and silence Hsp70 at cellular and animal level. At the same time, the antibody intervened the TLR receptor in DC cells further refined the regulation mechanism of Hsp70. This project will provide a basis for the study of the molecular mechanism of allergic asthma caused by house dust mite.

尘螨是引起过敏性哮喘的主要因素,鉴定其致敏成分是哮喘诊治重点。前期工作中：成功构建尘螨细胞系，提取该细胞exosomes，证明尘螨exosomes加重哮喘小鼠炎症反应，进一步研究发现尘螨exosomes中Hsp70表达量较细胞内高。Hsp70是新命名的粉尘螨过敏原Derf28，可以通过TLR/MyD88调节DC细胞，影响CD4+T细胞分化，参与免疫反应。哮喘发生时，变应原被粘膜DC细胞识别捕获，刺激CD4+T细胞免疫应答。基于上述研究提出假设：尘螨exosomes通过Hsp70/TLR/MyD88调节DC细胞，影响CD4+T细胞分化，促进小鼠过敏性哮喘炎症反应。本项目拟在细胞及动物水平，过表达及沉默Hsp70表达，论证尘螨exosomes在哮喘中的作用机制；同时抗体干预DC细胞TLR受体，对Hsp70调控机制进一步细化。本课题将为研究尘螨导致过敏性哮喘的分子机制奠定基础。

尘螨是引起哮喘的主要因素,哮喘是最为常见的严重威胁公众健康的慢性气道炎症性疾病。阐明哮喘的发病机制，以便对其进行诊断和防治，具有重要的社会意义和经济效益。外泌体（exosomes）是一类由多种细胞分泌的、直径约为50-150nm膜性细胞囊泡，在哮喘发生发展过程中，机体自身exosomes参与了抗原呈递、免疫调节、炎症反应等病理过程，而尘螨作为引起过敏性哮喘的主要病原体，未见自身外泌体相关研究报道。.本研究首次提取了粉尘螨外泌体，根据提取方法我们推测该外泌体主要来源为粉尘螨分泌物，排泄物，螨体等处外泌体的一个混合模式，我们通过电镜，粒径分析，WB三组方法验证了所提外泌体。同时我们使用LC-MS/MS和sRNA-Seq方法测序了粉尘螨外泌体中蛋白种类和miRNA序列。通过蛋白测序我们共获得72种蛋白，其中包含WHO/IUIS推荐的29种过敏原蛋白；通过小RNA测序获得42中保守miRNA，32种新miRNA。.后序我们进一步验证了粉尘螨外泌体在粉尘螨过敏性哮喘中的免疫原性和致敏性。免疫原性：通过ELISA，WB，Dotblot检测尘螨过敏性哮喘患者血清和外泌体的反应性，检测到尘螨外泌体具有良好的免疫原性。同时使用粉尘螨致敏模型检测了外泌体具有良好的致敏作用，血清中IgE和IgG2a增高，且BALF中TH2，TH17相关免疫因子IL4,IL5,IL13,IL17显著增高，上皮细胞和巨噬细胞相关炎症因子IL33,TSLP,TNF-a,IL6表达增高。反应了粉尘螨外泌体的致敏作用，及可能通过影响上皮细胞和巨噬细胞发挥作用。.我们进一步用粉尘螨外泌体体外处理上皮细胞16-HBE和巨噬细胞NR8383，之后示踪了粉尘螨外泌体可被上述两种细胞大量内吞，且内吞后相应细胞因子IL33,TSLP,TNF-a,IL6显著增高。同时使用转录组测序技术检测了该两组细胞在尘螨外泌体处理后，细胞转录组变化，通过火山图，GO分析，KEGG分析，以及PPI分析，结果显示两组细胞皆以免疫相关通路和细胞因子变化为主。. 此次研究首次提取到粉尘螨外泌体，且解析了该外泌体内含物，同时证实了粉尘螨外泌体的免疫原性和致敏性，初步探讨了尘螨外泌体的作用机制。该研究相对全面的对粉尘螨外泌体进行了研究，可以更广泛的拓宽粉尘螨致敏研究。