应用hTERTcDNA 建立胎儿永生化内耳前体细胞系并检测其分化的信号调控机制

建立具有毛细胞分化潜能的永生化细胞系是内耳毛细胞分化研究的前提和耳蜗细胞移植的基础。本研究中我们拟采用SP方法分选胎儿内耳前体细胞，以脂质体转染法将外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT) 基因导入细胞，通过保持细胞端粒酶活性来延长细胞寿命，从而建立人永生化内耳前体细胞系。并采用实时荧光定量PCR法、western blot、免疫荧光染色检测Notch通路各信号分子在该细胞系分化过程中的具体变化，然后阻断相关信号对比阻断前后细胞的分化状况，从而确定Notch在内耳前体细胞分化中的具体信号转导途径。该研究所得到的永生化细胞系避免了DNA肿瘤病毒基因等传统永生化基因的不安全性，可为人内耳发育分化的基础研究提供理想的操作平台。而对该细胞系分化的信号调控机制的确定对于感音性耳聋等多种内耳疾病的治疗也具有重要的指导意义。

感音神经性聋是耳科常见病，治疗棘手，耳蜗细胞移植是目前最有希望恢复听力的方法。该疗法的关键是找到具有毛细胞分化潜能的永生化细胞系。本实验拟建立胎儿耳蜗前体细胞永生化细胞系，并检测Notch信号通路相关信号分子对细胞分化的影响。.计划调整说明：本课题基本按原计划进行，作了适当调整。1.由于伦理限制，及从结构细微的耳蜗所能获得细胞数量很少，改用新生大鼠实验。2.免疫组化研究发现，ABCG2在内毛细胞及外毛细胞顶端均表达，因此大鼠内耳基底膜的细胞培养中，ABCG2不宜作为干细胞的分选标志，因此取消SP细胞分选。根据内耳前体细胞在干细胞培养液中可悬浮生长形成细胞球的特性，培养和分选内耳前体细胞。3.在Notch信号通路研究中，采用效率更高的RNA干扰方法替代原计划的反义寡核苷酸链的方法阻断Notch信号通路相关信号分子。.研究内容和结果：1.建立了耳蜗基底膜取材、细胞培养、前体细胞鉴定及诱导分化的方法；2.通过对不同形态的前体细胞球的深入研究，确定了最具应用价值的细胞球；3.采用pCI-neo-hTERT质粒转染，成功获得了永生化的新生大鼠耳蜗前体细胞系，发现被转染细胞端粒酶活性增强，但保持细胞的原有特性，hTERT可能作用于bcl2和apaf1之间的某个环节。4.免疫组化研究发现，ABCG2在新生大鼠耳蜗基底膜毛细胞顶端表达，因此不能作为耳蜗基底膜前体细胞分选的可靠标志。5.根据文献方法，成功构建并筛选pSilencer 4.1-Notch1-siRNA质粒和pSilencer 4.1-Notch3-siRNA质粒，并检测 Notch通路中的各信号分子在内耳前体细胞分化过程中的具体变化，发现Notch通路中Notch1对毛细胞定向分化起关键作用，Notch3未发现直接作用。6.以γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路，观察体外培养的耳蜗前体细胞分化情况，发现抑制Notch信号通路后，前体细胞分化为毛细胞数量增加。.意义：以耳蜗细胞移植为目标的毛细胞诱导分化研究，具有良好的临床应用前景，已有不少移植细胞成活的报道。在胚胎发育过程中，毛细胞与耳蜗神经节的相互作用如何，耳蜗电位在保持毛细胞功能上的作用如何，这些问题的解决应该是移植细胞实现功能的前提。