黄酮类甲基转移反应蛋白复合体的研究

Flavonoids are the most numerous natural products dispersed throughout the plant kingdom. Flavonoids have been widely reported to display remarkable positive effects on human and animal health, and therefore are major active plant nutraceutical ingredients. The O-methylation of flavonoids improves their intestinal absorption, metabolism stability and also lifespan in human body. Methylated flavonoids are able to arrest Leukemia cells in G1 stage and thus display cancer cell apoptosis inducing abilities. Flavonoids methylation is mediated by O-methyltransferases which transfer methyl group from S-adenosyl-L-methionine to their substrates, flavonoids, and release S-adenosyl-L-homocystine, a natural inhibitor of methyltransferases. Two SAM salvage cycle enzymes were detected to bind with Arabidopsis flavonoids methyltransferase CCoAMT7 in our preliminary data. This observation arose us a question that if SAM salvage cycle enzymes function together with CCoAMT7 in vivo so that to provide SAM directly to and also convert SAH quickly to minimize feedback suppression on CCoAMT7. Here, we propose to investigate protein-protein interactions between CCoAMT7 and all the SAM salvage cycle enzymes. After detecting the interactions, we are planning to check their in vivo binding and binding regulations by SAM salvage cycle intermediates such as methionine, ATP and SAM through split luciferase assay. We will further compare the methyl transfer activity of CCoAMT7 with or without formation of protein complexes through using both recombinant proteins and plant total proteins from wide type or T-DNA insertion mutant plants. This work will help us to understand the organization of biological reactions and also provide a new strategy for methylated flavonoids production.

黄酮类化合物是广泛分布于高等植物的重要天然产物，具有很强的生物学活性，是许多保健品的主要成分。黄酮类化合物的甲基化修饰可以提高其吸收性、稳定性和活性，使癌细胞停留在G1期而表现出抗癌的功能。黄酮类化合物的甲基化修饰由黄酮甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸为供体催化完成，同时释放S-腺苷-高半胱氨酸，SAH可反馈抑制甲基转移反应。我们的初步研究结果显示，拟南芥黄酮甲基转移酶CCoAMT7可与SAM循环途径中的两个酶相互作用。因此，我们推测黄酮甲基转移酶与SAM循环途径的交叉可发生于蛋白水平。所以我们拟研究拟南芥黄酮转移酶CCoAMT7与SAM循环途径酶的结合，研究蛋白复合体的存在以及SAM、ATP和甲硫氨酸等对此的调控，解析蛋白复合体对黄酮转移反应的影响。本课题的完成将有助于阐明植物体对SAM定向供给和SAH反馈抑制解除的调控机制，同时提供抗癌天然产物--甲基化黄酮类化合物生物学的新合成技术路线。

酚类化合物是植物次生代谢物的主要组成部分，在植物抗逆、抗病过程中发挥重要的作用。酚类化合物一般具有较强的抗氧化能力，可以清除超氧化物自由基，因此作为食物对于人类的健康具有中一定的促进作用，在保健品和功能性食品中具有广泛的应用。酚类化合物的修饰极大地丰富了黄酮类化合物的种类，并赋予酚类化合物不同的生物学功能，在一定程度时是各种中草药不同药物学的主要原因，但是其修饰过程尚有很多未解谜题。申请人在此项目中主要研究了酚类化合物甲基化修饰的过程，利用酵母双杂交，发现酚类化合物甲基转移酶CCoAMT7可以结合SAHH，而SAHH是甲基转移酶CCoAMT7的甲基前体SAM合成的关键酶。我们利用分裂荧光素酶实验在体内证实了两个蛋白的相互作用。有趣的是，我们在分裂荧光素酶实验过程中发现CCoAMT7可以结合合成SAM的合成酶SAMS，但是二者的直接结合在酵母实验中未能检测到。为此，我们进一步分析了SAHH与SAMS的结合，在酵母和植物中都证实SAHH可以作为一个支架，同时结合SAMS与CCoAMT7，使SAMS产生的SAM直接被CCoAMT7利用，而CCoAMT7转移甲基后产生的SAH可以被SAHH分解从而解除SAH对于CCoAMT7的反馈抑制。我们还分析了上述基因的突变体植物，发现CCoAMT7转基因植物细胞壁酚类化合物阿魏酸含量显著降低；SAMS突变体阿魏酸变化较小，可能与基因冗余有关；sahh1突变体纯合致死，而抑制SAHH的转基因植物阿魏酸含量也显著降低。上述工作初步解析了酚类化合物甲基转移酶过程中的分子机制，为利用酚类化合物改进植物抗性和营养具有了一定的理论指导意义。