埃博拉病毒基因组连续T-C突变的形成机制及其对病毒适应性的影响

Ebola virus is highly contagious with a high death rate, and there is a possibility of re-outbreak in the African continent and even other continents. We for the first time discovered serial T-C mutations in the Ebola virus genome (the results were published in Nature magazine). In a subsequent study, we also found that more and more serial T-C mutations accumulated in the late Ebola outbreak (the results are in review in Lancet ID). The mechanism of these serial T-C mutations is not fully understood, and its significance on the virulence and viability of the deadly virus, as well as the interaction between the virus and host needs further study. In this project, we will use molecular biology methods to construct Ebola virus serial T-C mutation fused with reporter gene EGFP/Luc, and transfect these constructs into Hela cells, so as to study the RNA editing mechanisms of host cell on the T-C serial mutations. We will also analyze the impact of the serial mutations on the stability of the RNA transcripts and gene expression levels of reporter genes, and will apply high-throughput sequencing to assess the influence of the serial mutations on adaptation of the viral sequences in the host cell. This study aims to illustrate the mechanism and significance of serial T-C mutations on Ebola virus transmission and evolution.

埃博拉病毒传染性强，致死率高，存在着在非洲大陆甚至其它大陆再次暴发疫情的可能性。我们在对埃博拉病毒的研究过程中，首次发现了病毒的基因组中存在着连续T-C突变现象（结果发表在Nature杂志上）。在后续的研究中，我们又发现在埃博拉暴发疫情的后期，这种连续突变现象呈现积累趋势（结果在Lancet ID审稿中）。这种连续T-C突变现象发生的机制尚不完全清楚，其对病毒致病性和生存能力的影响、以及病毒与宿主之间相互作用也尚待研究。本研究拟采用分子生物学手段，构建埃博拉病毒连续T-C突变与报告基因EGFP/Luc融合表达载体，转染Hela细胞，分析宿主细胞RNA编辑机制对病毒连续突变位点附近序列的影响以及连续突变对RNA转录物的稳定性和基因表达水平的影响，应用高通量测序技术分析含有连续突变位点的序列在宿主细胞中的适应性，阐明连续T-C突变对于埃博拉病毒传播和进化的意义。

本项目按照计划完成研究任务。该项目的目标是通过合成埃博拉病毒连续突变片段，连接载体转入真核细胞的方法，研究连续T-C突变对病毒基因的表达调控以及对病毒适应宿主能力的影响，阐明连续T-C突变的发生机制和对病毒适应宿主的意义。第一部分工作已在2017年完成。生物信息学方法分析疫情不同阶段埃博拉病毒的序列，发现本次疫情的埃博拉病毒出现较高频率的T-C突变，且这种突变呈现出逐渐累积的趋势。第二部分分为三个阶段，第一阶段，统计埃博拉病毒基因组T-C突变相关信息，设计合成野生型、突变型片段并将其连入报告基因的下游。同时，构建腺苷脱氨酶真核表达载体。第二阶段，用第一阶段完成的野生型与突变型质粒转染293T细胞，检测报告基因表达量的差异。第三阶段，将体外转录物与重组ADAR混合，观察电泳迁移率的改变。.研究结果表明，埃博拉病毒连续T-C突变对下游基因表达调控无明显影响。EMSA实验证明连续T-C突变使其与细胞内的腺苷脱氨酶结合能力明显下降，可能是病毒逃避宿主基因编辑的作用机制之一。