Stk33基因在精子发生障碍中的作用与机制研究

Male infertility usually shows impaired spermatogenesis, in clinics it mainly appears as oligozoospermia, asthenozoospermia and/or teratozoospermia, and the most severe appearance is non-obstructive azoospermia. Although many genes have been found to be essential for spermatogenesis, most of them didn’t have evidence in impaired spermatogenesis in clinical patients. Our laboratory previously found the same nonsense mutation of Stk33 in different individuals in patients with non-obstructive azoospermia, which could lead to premature stop of protein translation. Using knockout mice, our preliminary studies showed that Stk33-/- mice had abnormalities of spermatogenesis, decreased number of spermatids together with apoptosis, and male sterility. According to these preliminary data, Pex3 might play essential functions in impaired spermatogenesis. This study will use knockout mouse models and mouse mutants simulating disease mutants in patients, proteomics analysis, genomic analysis and clinical male infertility samples, in vivo and in vitro experiments, with the aim to systemically reveal the functions and mechanisms of Stk33 in impaired spermatogenesis, to characterize its roles in male infertility, and to provide new clues for genetic causes and development of diagnosis methods for male infertility.

男性不育通常表现为精子发生障碍，临床上显示为少弱畸形精子症，其中最严重的是非梗阻性无精子症。虽然在动物模型中发现很多基因调控精子发生，但绝大部分未能找到人类精子发生障碍相关的证据。本实验室前期围绕非梗阻性无精子症全外显子测序发现Stk33基因在不同的个体存在相同的无义突变，导致蛋白编码区提前终止，小鼠中敲除Stk33基因初步研究显示可导致雄性不育，睾丸中精子细胞数量减少伴随凋亡，提示Stk33可能是精子发生障碍重要调控基因。本研究拟使用小鼠敲除模型与模拟临床疾病突变的小鼠基因突变模型，利用蛋白质组学、基因组学方法和临床不育人群资源，体内体外实验相结合，系统阐明Stk33基因在精子发生障碍中的作用和分子机制，阐明其与男性不育的关系，为男性不育的遗传学病因解析和诊断提供新思路。

本项目围绕无精子症测序发现的无精子症突变相关激酶Stk33在精子发生中的作用开展研究。利用CRISPR/Cas9技术构建Stk33基因敲除模型，发现Stk33-/-雄性小鼠不育，其精子头部与尾部出现明显畸形，且精子数目在VII-VIII期出现明显下降；单精子胞浆注射（ICSI）实验发现Stk33-/-精子呈现卵子激活障碍和早期胚胎发育异常。.利用睾丸蛋白，进行STK33体外激酶反应蛋白质组学研究，发现一系列底物磷酸化位点，氨基酸基序富集分析得出其潜在底物磷酸化位点具有一定的基序特征，在+2位有氨基酸Y的富集。鉴定的STK33下游底物蛋白包括AKAP3、AKAP4、Dpy19l2等多个精子形成关键蛋白。进一步研究发现，STK33相互作用蛋白AKAP3和AKAP4在Stk33-/-精子中表达量下降，提示二者为STK33激酶在精子发生过程中重要的下游磷酸化底物。Dpy19l2缺失精子中卵子激活关键蛋白PLCZ1下调，其下游通路可能在Stk33缺失的卵子激活异常中发挥一定的作用。Stk33-/-小鼠睾丸磷酸化修饰谱鉴定1087个异常修饰磷酸化位点，主要富集在纤毛发生相关蛋白，其中辐轮蛋白RSPH3b磷酸化修饰水平异常下调。果蝇中dRSPH3与RSBP5相互结合以稳定轴丝结构，该蛋白磷酸化异常可能在Stk33-/-精子的尾部异常中发挥重要调控作用。.构建的模拟临床精子发生障碍无义突变的Stk33KI雄性小鼠生育异常，精子发生障碍；而将雌性Stk33-/-小鼠与雄性Stk33KI小鼠交配得到Stk33-/KI小鼠相对于Stk33KI小鼠则呈现为更为严重的精子数量减少和精子畸形表型，表明该无义突变可能在临床男性不育精子发生障碍中具有重要意义。.本项目围绕Stk33激酶在精子发生中的功能开展了系统深入的研究。研究结果有助于完善生殖生物学理论，揭示男性不育的病理机制，为男性不育提供新的候选诊断靶标。