Aquamicrobium sp. hun6降解皮考啉酸及其衍生物的机理研究

Picolinic acid compounds (PC) is often formed in biodegradation of nitrobenzene compounds (NC), which will pollute the environment once again. Therefore the biodegradation of PC is an important scientific problem for the absolute elimination of NC pollutions. And the metabolic mechanism of PC is not well known and especially biodegradation of important derivates of picolinic acid are not reported up to now.The applicant in the earlier time had isolated an efficient PC-degrading strain Aquamicrobium sp. hun6. This study will focus on the metabolic mechanism of PC in the efficient PC-degrading strain hun6. For the first, during the biodegradation of important PC the metabolites would be identified and the metabolic pathway would be elucidated. For the second, there are two methods for cloning genes (cluster): (1) The mutants DNA-library would be constructed for cloning the important PC-degrading functional gene(cluster) together with SEFA-PCR ; (2) The key enzymes of strain hun6 purified from the disrupted cells were tested by MALDI-TOF-MS, and the sequence of amino acid could help to deduce the degrading gene too. At last, the enzymatic characteristics would be tested after the genes of key enzymes were expressed and purified. This project would help to elucidate the metabolic mechanism of PC, and lay a theoretical foundation for applying strain hun6 to complementary metabolism of NC with NC-degrading strains.

硝基苯类化合物（Nitrobenzene Compounds简称NC）在生物降解过程中常会形成中间死产物皮考啉酸及其衍生物（Picolinic acid Compounds简称PC），对环境造成二次污染。因此，PC的生物降解成为彻底消除硝基苯类化合物污染的关键科学问题。目前，PC的代谢机理尚不完善，特别对于其中一些重要衍生物的降解尚未见报道。本研究以申请者已分离到能广谱、高效矿化PC的菌株Aquamicrobium sp. hun6为研究对象。以PC中的重要代表性化合物为底物，通过底物利用和产物鉴定技术解析它们的代谢途径，揭示PC代谢产物形成规律；通过两种策略来克隆降解的关键酶基因（簇），即转座子随机插入突变结合SEFA-PCR的方法以及功能酶纯化技术结合蛋白质谱检测的方法；最后对其中的关键酶基因进行表达并研究酶学特性。预期结果有助于阐明微生物降解PC的代谢机理，并为菌株hun6今后用于硝基苯类化合物的互补代谢应用提供理论依据。

按照项目计划所确定的研究内容，自2015年以来，开展了“Aquamicrobium sp. hun6降解皮考啉酸及其衍生物的机理研究”相关基础研究工作。研究中利用降解菌株对三种典型皮考啉酸及其衍生物（皮考啉酸、5-氯皮考啉酸和5-甲基皮考啉酸）进行了降解和代谢途径研究，结果表明三种底物都会在降解菌株作用下发生吡啶环6-位的羟基化反应，之后发生快速的开环从而被微生物降解，而在代谢过程中有着不同的代谢方式和过程。在研究代谢基础上，进行了起始关键羟基化酶基因的克隆，使用了纯化吡啶环6-位羟基化酶的研究思路，通过弱阴离子琼脂糖凝胶柱、分子筛等方法得到了较为纯化的酶蛋白，从蛋白质谱检测中得到了蛋白的多肽指纹图谱信息，通过比对和功能分析确定了该羟基化酶基因是一种广谱底物的脱氢酶命名为PicA，并进行了蛋白表达和功能验证工作，该酶可以对若干种芳香环或氮杂环类化合物有反应活性，但在皮考啉酸及其衍生物的羟基化反应中发挥作用还未见报道。另外，利用转座子插入突变的方法结合降解菌株f1的全基因组测序和相关代谢机理分析结果得到了间位开环酶基因picD基因，该开环酶底物多为儿茶酸类化合物，用于本研究中的6-羟基化皮考琳酸类化合物降解的报道目前还没有。在与降解菌株f1的全基因组测序结果比对分析中显示picD基因两侧还存在着与皮考啉酸及其衍生物降解相关的pic基因簇，包含picR、picD、picE、picG1、picG2、picH和picI在内的7个相关基因，并进行了代谢通路和相应关键酶基因的分析和验证工作，从而最终得到了皮考啉酸类化合物的生物降解途径。本研究为硝基苯类化合物彻底的生物降解提供了理论依据。本项目目前共计发表SCI期刊论文3篇，中文核心期刊论文1篇，参加国内学术交流会议2次，已培养研究生3名。