c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)促进巨细胞病毒入侵宿主细胞的分子机制研究

Viral entry is a critical step for virus replication,whose inhibition allows blocking of the virus replication at the very beginning and avoiding viral diseases. Human cytomegalovirus (HCMV) infection is one of the leading causes of birth defects. Its primary infection and reactivation also cause severe and even life threatening diseases in immunocomprimised individuals. The mechanism of HCMV entry has not been fully elucidated. It has been reported that the signaling events stimulated upon virus binding to its receptors are important for HCMV entry. While screening a library of known cellular signalling inhibitors,we identified several structually distinct c-Jun N terminus kinase(JNK) inhibitors as potent HCMV entry inhibitors. Since JNK is known to be activated downstream of many cell membrane receptors(including HCMV entry receptors),we hypothesize that HCMV activates JNK during entry, which in turn enhances viral entry. In this study, in order to test our hypothesis, we will address the following three key questions: 1) the role of JNK in facilitating HCMV entry into multiple cliniacally important cell types; 2)the effect of JNK inhibition on key steps of HCMV entry: adhesion,internalization and intracellular transporting; 3)indentify the JNK substrates involved in cytoskeleton remodeling and intracellular transporting that are critical for HCMV entry. This study will provide new insights into the molecular mechanism of HCMV entry, potentially lead to new approaches, and identify novel drug targets to control CMV infection and its related diseases.

病毒入侵宿主细胞是病毒复制的首要步骤。阻止病毒入侵能够在源头上阻断病毒增殖，防止疾病发生。人巨细胞病毒（HCMV）是造成新生儿出生缺陷及在免疫缺陷病人中引起严重疾病的重要病原体。HCMV入侵细胞的机制未被充分阐明,有数据表明病毒受体激活的细胞内信号转导对HCMV入侵至关重要。我们在筛选抗病毒化合物时发现多种不同结构的c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)抑制剂可以有效阻断HCMV病毒入侵宿主细胞。JNK可以被多种细胞膜受体激活，由此我们提出假说：巨细胞病毒入侵细胞时激活JNK依赖的信号通路，并以此促进病毒入侵。本课题将围绕该假说深入探讨：1）JNK在临床病毒株入侵不同类型细胞时的作用；2）JNK抑制剂对病毒和细胞质膜融合、病毒内吞和转运等过程的影响；3）与细胞骨架和转运相关的JNK底物在HCMV入侵细胞过程中的作用。本课题将有助于揭示HCMV入侵细胞的分子机制，为开发抗病毒药物提供理论基础。

人巨细胞病毒（HCMV）是一种普遍感染的机会性病原体，巨细胞病毒在感染者体内可以长期潜伏，并经常复发。HCMV一般在健康成人中不引起疾病， 但它是造成新生儿听力、视力丧失以及智力障碍的首要病因。目前，没有可以防护巨细胞病毒的疫苗，并且抗病毒药物比较单一，有较强的副作用并且会产生耐药性，亟需开发新的抑制巨细胞病毒的药物。我们前期完成了针对615种已知靶位的小分子化合物库的筛选工作。在筛选过程中，发现多种不同化学结构的c-Jun 氨基末端蛋白激酶(JNK)抑制剂都可以有效的抑制巨细胞病毒复制。在本课题中，我们主要研究了JNK抑制剂SP600125抑制巨细胞病毒的机制。建立了HCMV临床株的培养和感染体系，同时在实验株和临床株中进行了以下实验。首先通过生长曲线确认JNK抑制剂SP600125有效抑制巨细胞病毒复制，并且设计针对JNK的shRNA，利用其敲除细胞内的JNK1或JNK2进而明确下调JNK1或JNK2均对病毒感染有抑制。病毒蛋白表达情况表明SP600125对巨细胞病毒复制的影响是立早期事件。进一步分析了SP600125对病毒的结合和入侵没有影响，利用RT-qPCR方法检测细胞中病毒RNA表明JNK抑制剂SP600125抑制了病毒立早期基因IE1/2的转录。IE1/2是病毒进入细胞后最早表达的基因之一，它们可以调控病毒晚期基因的表达，和SP600125处理后病毒蛋白表达的表型一致。本课题研究结果表明JNK在巨细胞病毒感染细胞中起十分重要的作用，抑制JNK的活性可以有效抑制巨细胞病毒复制。JNK抑制剂可能成为一类新的潜在的抗巨细胞病毒化合物，JNK作为蛋白激酶是一个可行的抑制巨细胞病毒的药物靶点。本课题为开发抗病毒药物提供一定的理论基础。