NYD-SP27调控绵羊精子发生及获能的分子机制

PLCζ plays an important role in reproductive development. The effect on early spermic occuring and development and the mechanism of phospholipase C zeta (PLCζ) for egg activation is becoming a hot topic in studies of reproductive development. However, the specific protein gene 27(NYD-SP27) in the development of testis has been identified as a new intrinsic decapacitation factor (DF) in sperm, which belongs to the PLCζ family. It has been confirmed that NYD-SP27 plays a pivotal role in the regulation of sperm capacitation in mouse, but there are no related reports on sheep so far.The research idea of this study is to screen effective shRNA of sheep NYD-SP27 gene to construct interference expression vectors,and coated it with liposomes ,and then the recombinant plasmid was injected into the sheep testicular tissue ,to detect the effects of down-regulated of NYD-SP27 on sheep spermatogenesis and sperm capacitation;, to detect Eukaryotic expression vector for NYD-SP27 gene was constructed, recombinant plasmid which peridiumed by lipofectamine was injected into the sheep testicular tissue to detect whether over-expressing of NYD-SP27 inhibit the expression of PLCζ in testicular tissue or sperm and its localization. The study would provide a scientific basis for revealing the functionatin of NYD-SP27 for spermatogenesis and sperm capacitation。 To detect the influence on spermatogenesis and regulatory pathway of related signals by the over-expressing of NYD-SP27,and to study the NYD-SP27 expression and localization in the testes or the sperm.

PLCζ在生殖发育中发挥重要，其对精子的发生发育及卵母细胞激活等相关研究日益成为生殖发育的研究热点。然而，PLCζ家族中的睾丸发育特异性蛋白-27基因( NYD-SP27)，却被认为是一种新的精子内源性去能因子。已证实NYD-SP27在小鼠精子获能上具有重要作用，但NYD-SP27在绵羊精子获能中的作用未见相关报道。本项目的研究思路为：筛选绵羊NYD-SP27基因的有效shRNA构建干扰表达载体，用脂质体包被后注入绵羊睾丸组织中，检测NYD-SP27表达下调对绵羊精子发生及获能的影响；构建绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体用脂质体包被后注入绵羊睾丸组织中，检测NYD-SP27的过表达对精子发生发育及精子相关信号调控通路的影响，并研究NYD-SP27在睾丸或精子中的表达和定位，为揭示NYD-SP27在精子发生及获能中的作用机制提供一定的科学依据。

本课题以新疆绵羊为研究对象，以NYD-SP27基因为基础展开在绵羊精子发生及获能方面的相关实验内容，取得以下研究成果：.1. 我们采用分子生物学方法，扩增NYD-SP27基因；结果显示NYD-SP27基因全长为1901bp，其中只含有1617 bp组成的开放阅读框(ORF)，共编码538个氨基酸。.2. 成功构建NYD-SP27基因的稳定细胞系；应用生物学软件设计4条靶向干扰片段，并筛选出干扰效果较好的NYD-SP27基因下调表达载体NYDSP-shRNA-3。.3. 成功构建NYD-SP27基因 上调表达载体pmcherry-Flag-NYDSP-P2A。并将上调和下调载体质粒注射到绵羊睾丸中，成功的对NYD-SP27基因在绵羊睾丸和附睾中的表达和定位进行观察和分析；并采集实验组和对照组绵羊精子，经姬姆萨染色，对精子的形态进行分析，表明NYD-SP27基因下调对绵羊精子的发生和形成具有作用。.4. 将上调和下调载体质粒注射到绵羊睾丸中，采集实验组和对照组中精子，经透射电镜观察，对三组精子的头部质膜、尾部质膜和尾部质膜等超微结构进行分析；成功分析出NYD-SP27基因的干扰对绵羊睾酮激素的升高具有促进作用；并对精子超激活运动相关肌动蛋白的表达具有调控作用，表明NYD-SP27基因下调对绵羊精子的发生和获能具有调控作用。.5. 体外受精结果表明NYD-SP27基因的下调可以有效提高绵羊精子体外受精率和促进早期胚胎发育，表明NYD-SP27基因下调对绵羊精子的获能具有调控作用。表明NYD-SP27基因下调对绵羊精子的获能具有调控作用。.6. 将采集到的实验组和对照组绵羊精子，经超声破碎后进行ELSIA检测，成功检测出NYD-SP27基因的干扰对精子环磷酸腺苷酸和蛋白激酶A的表达产生调控作用；并对绵羊精子活率产生提高；表明NYD-SP27基因干扰对绵羊精子的发生具有促进作用，并对精子的获能亦具有调控作用。. 以上成果提示：NYD-SP27基因下调在绵羊精子的发生和获能方面具有作用。课题组，共发表论文4篇，在投论文1篇，今后2年内发表论文1-3篇。培养硕士研究生3名，后续还有一名研究正在进行后续的延伸内容，达到了预期目标。.关键词：绵羊；NYD-SP27基因；下调；发生；获能