黄芪道地药材“金井玉栏”的科学内涵研究

According to the textual and market research, although “Jinjing Yulan”(The outer ring consists of bark and phloem is white, while the center consist of xylem or pith is yellow on the cross section of the medicinal material) is one of the important characters of “assessing quality by distinguishing the features of traditional Chinese medicinal materials (TCMM)” of Dao-di herbs , Astragali radix, it’s scientific connotation haven’t been revealed. For early discovery, the color feature of xylem and phloem indicated by “Jinjing Yulan ” is related to the distribution and accumulation of flavonoids and saponins in different tissues. This project brings forward a scientific hypothesis: The expression of genes related to biosynthetic pathway of flavonoids and saponins in different tissues of the root of Dao-di herbs , Astragali radix, affects the distribution and accumulation of flavonoids and saponins in tissues, which contributes to “Jinjing Yulan ”..This project is based on preliminary study, determining the color and secondary metabolites by means of optical density sensor and metabonomics analysis technique, to expound the relationship between structure and chemical composition of the “Jinjing Yulan ”; sets up the transcriptome library of different tissues by the technology of micro laser cutting and transcriptome, analysing the differential expression of genes related to biosynthesis of flavonoids and saponins, verifying their functions, to expound the external performance and formation mechanism of “ structure- chemical composition- gene expression” of “Jinjing Yulan ”, and to expound the scientific connotation of “Jinjing Yulan ” of Dao-di herbs , Astragali radix, from the aspects of structure, metabonomics and transcriptomics, in order to provide a theoretical basis for the identification of Dao-di herbs.

根据本草考证和市场调查，“金井玉栏”是黄芪道地药材辨状论质的重要特征之一，但其科学内涵尚未揭示。申请者前期发现“金井玉栏”所反映的木质部和韧皮部颜色特征与黄酮类皂苷类成分在不同组织中分布及积累有关。本项目提出科学假说：道地药材黄芪根不同组织中皂苷类与黄酮类成分生物合成途径的相关基因表达影响了两类成分在组织中分布与积累，使根的结构上呈现 “金井玉栏”。 本项目在前期研究基础上，应用分光密度仪与代谢组学分析技术对根不同组织结构进行颜色、次生代谢产物测定，阐明“金井玉栏”的结构特征与化学成分的关系；应用显微激光切割和转录组学技术，构建不同组织转录组文库，分析黄酮类和皂苷类成分生物合成相关基因的差异表达，并进行功能验证，阐明“金井玉栏”的“组织结构-化学成分-基因表达”的外在表现与形成机制，从组织结构、代谢组学和转录组学层面阐明黄芪道地药材“金井玉栏”的科学内涵，为道地药材的经验鉴别提供理论依据。

本研究探讨了黄芪“金井玉栏”的“组织结构-化学成分-基因表达”外在表现与形成机制，运用组织结构特征联合代谢组学和转录组学，阐明了道地药材黄芪“金井玉栏”的科学内涵。主要研究内容及结果如下：①通过本草考证和实地产地调查界定了黄芪“金井玉栏”术语。典型“金井玉栏”特征为次生木质部鲜黄色（金井），次生韧皮部白色（玉栏），两者以形成层为界，界限分明。并根据断面颜色，确定了4种不同类型“金井玉栏”。②开展了不同类型“金井玉栏”与次生代谢产物含量及配比关系研究，应用分光密度仪客观反应了“金井”和“玉栏”的颜色差异；运用UPLC-Q/TOF-MS对黄芪“金井玉栏”不同组织进行定性分析，结果表明，黄芪根中次生木质部黄酮种类多于次生韧皮部，次生韧皮部中皂苷类化合物多于次生木质部。③采用HPLC-DAD-ELSD法测定黄芪根4种类型“金井玉栏”不同组织中总黄酮、7种黄酮和5种皂苷的含量，结果发现黄芪根“金井”中总黄酮和7种黄酮类化合物总含量较高，“玉栏”中5种皂苷含量较高。④开展了黄芪“金井玉栏”不同组织抗氧化活性研究，结果表明，次生木质部DPPH抗氧化能力平均值高于次生韧皮部，典型“金井玉栏”抗氧化活性高于其它三种类型。ABTS 抗氧化能力研究结果与DPPH一致。⑤采用二代及三代转录组测序，构建了蒙古黄芪全长转录组数据库，结合蒙古黄芪不同器官异黄酮类和三萜皂苷类成分积累规律，筛选出与蒙古黄芪异黄酮类及三萜皂苷类成分生物合成相关的基因。⑥对蒙古黄芪中异黄酮类和三萜皂苷类化合物生物合成相关基因进行了克隆及序列分析，成功克隆了6条异黄酮生物合成相关基因（AmPAL，AmCHI，AmIFS，AmHID，Am4’-OMT，AmIF7GT），9条三萜皂苷类化合物生物合成相关基因：AmAACT，AmMVK， 2条AmDXR，AmFPS，AmSQS，2条AmSQE，AmCAS。⑦利用基因工程手段构建了AmPAL、AmSQS及AmCAS基因微生物表达载体，实现大肠杆菌或酿酒酵母中的高效表达。本项目以黄芪“金井玉栏”为研究对象，探讨了项目负责人提出的黄芪道地药材“金井玉栏”形成的内因和机制的科学假说，完成了预期计划。