miR-21调控EGFR通路影响星形胶质细胞活化的分子机制及对视神经损伤后再生的影响

The regenerative failure after optic nerve injury seriously affect the quality of the patients’ life. The excessive activation of the astrocytes after injuriy is the important factor that causes the regenerative failure of the optic nerve, while the EGFR signal pathway could regulate the process of astrocyte activation. Recent studies have found that miR-21 could regulate astrocyte activation. However, the effect of miR-21 on the molecular mechanism of EGFR signal pathway regulation and the nerve regeneration after optic nerve injuriy remians elusive. Based on the previous studies of the applicant, we focus on the core issue about the nerve regeneration after optic nerve injury to clarify the molecular mechanism of miR-21 regulating the astrocyte activation by employing cellular and molecular biology, optic nerve crush animal model, microinjection technology and electrophysiological technology, which will provide theoretical basis for exploring the nerve regeneration after optic nerve injury.

视神经损伤后再生困难，严重影响患者的生活质量。损伤后星形胶质细胞的过度活化是引起视神经再生障碍的重要因素，而EGFR信号通路可以调控这一活化过程。最近研究发现miR-21可以调控星形胶质细胞活化。但miR-21 对EGFR信号通路调控的分子机制及在视神经损伤环境下对神经再生的影响目前尚不清楚。本项目运用细胞和分子生物学、视神经损伤动物模型、显微注射技术及电生理技术等研究方法，在申请人前期研究的基础上，围绕视神经损伤后神经再生这一核心问题，阐明miR-21调控星形胶质细胞活化的分子机制，为探索视神经损伤再生提供理论依据。

哺乳动物的视神经主要由胶质细胞及视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）的轴突组成。非离断性视神经损伤后，受损轴突再生修复困难，最终导致不可逆性视觉功能障碍。视神经损伤后轴突再生困难，严重影响患者的生活质量。损伤后星形胶质细胞的过度活化是引起视神经再生障碍的重要因素，而表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路可以调控这一活化过程。本项目运用细胞培养技术、生物学技术、视神经损伤动物模型、显微注射技术及电生理技术等研究方法，围绕视神经损伤后神经再生这一核心问题，针对miR-21 对EGFR信号通路调控的分子机制及在视神经损伤环境下对神经再生的影响问题进行阐述。 .视神经损伤后，EGF表达增高，星形胶质细胞活化增强，轴突新生不足，微小miR-21表达降低，我们通过Westernblot、RealtimePCR、免疫组织化学证实了EGF表达增高诱导的星形胶质细胞活化程度与视神经损伤后轴突再生低下呈现正相关，这个相关性可能与miR-21的表达降低有关。为此，我们通过体外实验进一步验证，首先，向静息状态星形胶质细胞培养基内添加EGF，发现静息状态星形胶质细胞体积表达、凸起增多，转变为过度活化状态。在静息状态转变为过度活化状态过程中，伴随Pten表达降低。结合miR-21可以调控星形胶质细胞活化的最新研究成果，miR-21可使星形胶质细胞活化程度调控在适度活化状态，在该状态，星形胶质细胞可发挥合成、释放促进再生因子及不过度活化形成疤痕。为了证实miR-21的下游目标靶基因，我们通过荧光素报告基因技术发现Pten为miR-21的下游靶基因，且通过病毒转染技术过表达miR-21可提高Pten的表达水平，实现miR-21对下游信号的进一步调控。通过体内实验，我们将miR-21模拟物注射到视神经损伤大鼠视网膜下腔，发现Pten表达增高，星形胶质细胞活化程度降低，新生轴突数量增多。重要的是，我们借助视觉电生理技术发现过表达miR-21可以抑制星形胶质细胞的活化程度，提高视神经损伤后视觉诱发电位的峰值，缩短视觉诱发电位的潜伏期。通过体内外研究证实了miR-21调控下游靶基因Pten的表达进而抑制星形胶质细胞过度活化，促进轴突再生的新分子机制，这一研究为探索视神经损伤再生提供理论依据。