真菌防御素抗白色念珠菌的研究

Candida albicans is an opportunistic fungus that normally would not cause infections in humans. However, it would bring about infections in immunocompromised patients including those who have undergone cancer chemotherapy, organ transplantation and surgery, those infected with HIV, and those suffering from diseases of the immume system. The development of resistance of C. albicans to antifungal drugs currently used clinically is a matter of concern. Recently it has been disclosed that there is a direct association between drug resistance and biofilm formation in C. albicans. This explains the urgency for research and development of new antifungal drugs. In our previous investigations, we observed that fungal defenisn(plectasin) and its beta-turn were capable of inhibiting the growth of C. albicans both in planktonic form and in biofilm. The intent of the proposed study is to ascertain the domain of plectasin with the highest anti-Candida potency, and to conduct experiments to unravel the mechanism of its inhibition of planktonic C. albicans and C. albicans in biofilm. Hopefully, this would pave a new way for research and development of new antifungal therapeutics.

白色念珠菌是机会真菌，在健康人体不会引起感染，可是在癌症化疗、器官移植、外科手术以及感染HIV/AIDS 或其他一些免疫功能疾病引起的免疫系统损伤的病人就会引起感染。另一方面值得关注的是白色念珠菌对目前临床上所用的抗真菌药物出现耐药性问题。近来，研究发现白色念珠菌的抗药性和真菌本身所形成的生物膜有直接的关系。这两方面的因素增加了在研发抗真菌药物的紧迫性。从我们前期研究中，发现了真菌防御素plectasin和它的beta-折叠片断可以抑制游离态和生物膜态的白色念珠菌的生长。本次立项目的是寻找出真菌防御素的最强抗菌活性部位，再将其进行动物体内试验并研究该片断对游离态和生物膜的白色念珠菌的抑制机理，为抗真菌新药的研发开辟一条新路。

近年来，由于免疫功能低下的人口不断上升，再加上入侵性微创诊疗的广泛应用和器官移植手术的增多，使得念珠菌感染的个案也逐年增加。念珠菌也成为了最常见的院内感染病原菌之一。耐药性菌株的出现是全世界都要面对的问题。医生多数的做法就是加大用药剂量和混合用药。不幸的是，所有的抗真菌药物都具有细胞毒性，越高浓度越为明显。近年来，由于抗菌肽拥有特殊的作用机理，再加上化学合成工艺的改善，备受各国研究人员的关注。.本项目对真菌防御素Plectasin的多肽片断的结构改造，我们采用了抗菌活性向导法，分成两批次，合成了27条相关多肽的多肽库。我们挑选出其中抗菌活性最强的16号多肽作为研习对象（根据美国NCCLS（M27-A）测试法，其MIC为7.8 μM），首先测试了多肽的细胞毒性，包括多肽对人红血球的溶血性，以及多肽对人周边单核血细胞的细胞毒性。结果显示，16号及其它较有抗菌活性的多肽13, 14, 15号浓度为125μM的溶血率在2%以下，16号在7.8μM的浓度时，仅有0.07%；然后还使用小鼠系统性感染动物模型对16号多肽进行了体内抗菌活性的测试，实验证明多肽16号在体内实验中也可以有效的抑制白色念珠菌。同时，我们还展开了多肽抗真菌的作用机理的探究，首先，我们用荧光标记物对所研习的多肽进行标记，之后利用荧光共聚焦显微镜来观察多肽与真菌细胞的作用方式，同时还利用电子显微镜观察了多肽处理后的真菌的形态变化，我们发现，16号多肽可以在5分钟内吸附到真菌表面，60分钟可以完全渗透进整个真菌细胞，电子显微镜发现，多肽处理的真菌表面有白色颗粒物。我们利用RNA-seq技术检测差异表达基因，结果显示经多肽处理过的真菌有1701个基因出现差异表达（其中1077个上调，624个下调）；针对差异基因还做了GO富集分析，发现多数差异基因富集于细胞组成 （cellular component）;然后在差异基因Pathway富集分析中，我们发现差异基因富集于代谢通路的控制中。最后，我们测试了多肽处理后的真菌细胞的ROS的释放, 线粒体的变化，细胞膜麦角固醇的含量变化和SYTOX green的穿透能力。我们发现多肽16号可以诱发真菌细胞释放ROS，也可以增加真菌细胞膜的透性，不过，对真菌的线粒体和细胞膜麦角固醇没有明显作用。我们已经将本次项目发现的具有抗菌活性的多肽序列申请国家专利保护。