MicroRNAs在结核分枝杆菌感染树突状细胞中对TLRs/ MyD88信号转导通路的调控机制

微小RNA是近年来被广泛认可的基因调控子，通过与靶基因3′非编码区的碱基特异性配对导致其降解或翻译阻遏。结核分枝杆菌（MTB）与DC的相互作用是依赖C型凝集素和TLRs信号通路实现的，有关miRNAs调控TLRs/MyD88信号通路的研究，尚未报道。本研究利用miRNA芯片检测MTB感染前后DC中miRNA差异表达谱，筛选调控DC抗MTB感染的miRNAs，利用荧光素酶报告系统对TLRs信号通路的关键分子- - - - MyD88和TRIF的miRNAs进行功能验证，并构建miRNA过表达与抑制表达的慢病毒载体，建立MTB感染DC模型和小鼠模型，利用流式细胞仪、qPCR和蛋白印记技术，检测其TLRs信号通路中MyD88、TRIF等关键蛋白及细胞因子表达，验证miRNAs的靶向调控作用，揭示miRNAs调控DC中TLRs/MyD88信号通路及抗MTB感染的分子机制，为阐明MTB发病机理提供理论依据。

.1.本项目从健康人外周血中分离单核细胞，制备了成熟的DC与H37Ra、BCG感染的细胞模型，然后提取总RNA，采用miRCURY LNA™ microRNA Array芯片分析，结果显示DCs中高表达（标准值大于2）的miRNA具有85个，其中极显著高表达的有hsa-miR-142-3p、hsa-miR-21、hsa-miR-149、miR-144-3p、miR-17-5p和hsa-miR-638等，明晰了DC细胞感染H37Rv、H37Ra、BCG前后miRNA s差异表达谱。生物信息学预测显示，hsa-miR-142-3p、hsa-miR-149、 hsa-miR-638等小分子可以靶向TLRs/MyD88信号通路的IRAK、MyD88和MAPK等关键接头分子的调控，可能在DCs抗结核分枝杆菌的感染中起着重要的作用。.2.为了揭示miRNAs对TLRs/MyD88信号通路关键接头分子的调控机制，我们构建了相应的细胞模型，研究发现miR-203、miR-149、miR-142-3p 和miR-638可以分别靶向抑制TLRs/MyD88信号通路中的关键分子MyD88、IRAK-1和MAPK14，并抑制其下游基因NF-κB、TNF-α、IL-6的表达，负向调控结核分枝杆菌与RAW264.7巨噬细胞的炎性反应，揭示了miRNAs参与调控结核分枝杆菌在细胞内存活的机制。.3.通过对制备BCG感染RAW264.7的细胞模型，利用荧光素酶报告基因系统、Real-Time PCR 、Western blot和激光共聚焦等技术，研究发现BCG可诱导RAW264.7巨噬细胞发生自噬，感染BCG后miR-17-5p和miR-144-3p稳定性高表达，进一步研究发现miR-17-5p通过靶向抑制ULK1表达，miR-144-3p可靶向抑制自噬相关蛋白ATG4a的表达，负向调控细胞自噬的发生，并抑制自噬体和自噬溶酶体的成熟，证实miR-17-5p和miR-144-3p可能通过抑制自噬相关基因ULK1和Atg4a，抑制细胞自噬从而有利于BCG在巨噬细胞中存活，造成其在宿主细胞内潜伏感染。