青藤碱调控类风湿关节炎CCP抗原特异性T细胞TLR 2，4/ Myd88/NF-κB信号通路的研究

Citrullinated antigen-dependent T cell activation is the earliest change of rheumatoid arthritis (RA). Toll-like receptors (TLR), especially TLR-2 and TLR-4 signaling pathway, is an important mechanism of T cell activation and is followed by other mechanisms involved in inflammation, which play a decisive role in the pathogenesis of RA. Our prophase study suggests that SN could inhibit proliferation of cyclic citrullinated peptide (CCP)-induced RA peripheral blood T cell in vitro and T cell secretion of inflammatory cytokines IFN-gamma, and promote production of anti-inflammatory cytokines IL-4. To this end, we propose the hypothesis: SN play anti-inflammatory and immunosuppressive effects through regulating TLR 2,4 / Myd88/NF-κB signaling pathways of CCP antigen-specific T cells. To test this hypothesis, the project will use CIA mouse model and RA peripheral blood CCP antigen-specific T cell model, by real time PCR, western blot, immunohistochemistry, ELISA and other means, through combination of in vitro test and in vivo test. The project will clarify the immunosuppressive effects and molecular mechanisms of SN on RA, and provide new ideas for traditional Chinese medicine treatment of RA.

瓜氨酸化抗原依赖的T细胞活化是类风湿关节炎（RA）最早发生的改变。Toll样受体（TLR）尤其是TLR-2 和TLR-4 等信号通路是T细胞活化后启动炎症反应的重要机制，在RA 的发病中有决定性的作用。前期我们的研究提示青藤碱（SN）可抑制环瓜氨酸肽（CCP）诱导的RA患者外周血T细胞体外增殖, 抑制T细胞分泌炎性细胞因子IFN-γ，促进抗炎性细胞因子IL-4产生。为此，我们提出假说：SN可能通过调控CCP抗原特异性T细胞TLR 2，4/ Myd88/NF-κB信号通路发挥抗炎及免疫抑制作用。为了验证这一假说，本项目将通过CIA小鼠模型，RA外周血CCP抗原特异性T细胞模型，采用real time PCR、western blot、免疫组织化学、ELISA 等手段，通过体内试验结合体外试验，阐明SN治疗RA的免疫抑制作用的效应、分子生物学机制，为中药治疗RA提供新思路。

类风湿关节炎（RA）是以对称性多关节滑膜炎为主要临床表现的异质性、系统性疾病，呈慢性、进行性、侵袭性，病情可逐渐加重而形成永久型骨质破坏，并最终出现残疾，甚至累及脏器危及生命。Toll样受体（TLR）通过选择性地识别病原体中病原相关分子模式的保守结构及内源性配体，触发myd88依赖或非依赖途径，活化的滑膜成纤维细胞和巨噬细胞上调了促炎症性细胞因子、趋化因子和组织破坏性酶的表达，诱发局部炎症。并诱导效应T 、B 淋巴细胞分化，启动后继的适应性免疫应答。同时，形成了一个反馈环路，通过炎症过程生成的内源性TLR配体可以导致滑膜细胞的慢性刺激。在一定易感基因背景下，特定蛋白或多肽瓜氨酸化可能作为RA发病的初始抗原发挥致病作用，抗原依赖性T淋巴细胞的活化可能是最早发生的改变。青藤碱是从青风藤中提取的生物碱单体，治疗RA具较好的抗炎镇痛和抑制自身抗体产生的作用。本项目主要研究内容是青藤碱对RA外周血单个核细胞、成纤维样滑膜细胞（RAFLS）及胶原诱导性关节炎小鼠滑膜TLR 2，4/ Myd88/NF-κB信号通路的影响。结果显示：青藤碱可抑制脂多糖（LPS）刺激的RA活动期患者单核细胞TLR4、MyD88、NF-κB（P65）的表达和炎性细胞因子TNF-α；青藤碱预处理后以浓度依赖性方式抑制RAFLS中NO及PGE2产生，降低iNOS和COX-2产生；青藤碱抑制RAFLS中TLR4和MyD88表达、NF-κB活化及p-NF-κBp65表达；青藤碱可改善CIA小鼠的关节肿胀，降低关节AI评分，减轻滑膜炎性细胞浸润，降低血清TNF-ɑ、IL-17水平，下调滑膜TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA的表达。本项目在中医理论指导下，结合体内外实验研究模型，采用细胞生物学、分子生物学等现代科学研究方法，研究了青藤碱调控RA的TLR 2,4/ Myd88/NF-κB信号通路，治疗RA的作用机制，为中医药治疗RA寻找一个潜在的治疗途径，丰富其治疗RA的现代科学内涵。