人类胚胎内源性硫化氢的无创实时检测及其调控胚胎发育的作用机制研究

Gas composition is one of the most important factors affecting pre-implantation embryonic development, but there are few studies about other gas molecules except oxygen. Previous study illustrated that endogenous hydrogen sulfide (H2S) synthesized by oviductal epithelial cells and released in abnormal levels had an adverse effect on embryo transport and development by lowering oviduct muscle contraction, however, whether H2S has an direct effect on embryonic development is not demonstrated. Our preliminary result showed that exogenous H2S donor in physiological concentration has a positive effect on human pre-implantation embryonic development. However, How endogenous H2S signaling system modulates human pre-implantation embryonic development is still not clear. Detection of endogenous H2S with its fluorescent probe has an advantage of highly sensitive, highly selective, non-invasive and real-time, which received extensive attention in many fields. However, there is no study about the application of H2S fluorescent probe on detection of endogenous H2S in human pre-implantation embryos. This study attempts to do following research: 1) Evaluation of the detection performance and safety of endogenous H2S in pre-implantation embryos by H2S fluorescent probe; 2) Demonstration of the importance of endogenous H2S signaling system for pre-implantation embryonic development; 3) Reveal the mechanism(s) that endogenous H2S signaling system modulates pre-implantation embryonic development. This study will help to improve the understanding of the modulatory role of gas composition on pre-implantation embryonic development, and to provide scientific evidence for optimizing the in-vitro culture environment to improve the quality of pre-implantation embryos.

气体组成是影响植入前胚胎发育的重要因素之一，除氧气外对其它气体成分的研究相对较少。输卵管上皮产生的异常水平硫化氢可通过影响其平滑肌收缩从而导致胚胎转运及胚胎发育阻滞，但硫化氢是否直接影响胚胎发育并未阐明。我们初期研究结果显示生理浓度硫化氢供体可能具有促进人类植入前胚胎发育作用。但是内源性硫化氢信号系统调控人类植入前胚胎发育的作用机制尚不清楚。硫化氢荧光探针具有高灵敏性、高选择性、无损伤及实时检测等方面的优势受到各个领域工作者的关注。然而，尚无此探针应用于人类胚胎内源性硫化氢水平的无创实时检测。因此，本课题拟开展以下研究：1）人类滋养层细胞中H2S荧光探针的检测性能及其安全性评价研究；2）分析内源性H2S信号系统对胚胎发育的重要性；3）揭示内源性H2S信号系统调控胚胎发育的分子机制。通过本课题研究将增加对气体成分调控植入前胚胎发育的认识，为优化胚胎体外培养条件以提高胚胎质量提供科学依据。

硫化氢（H2S）是一个重要的气体信号分子，近几年研究发现它在配子的相关生理过程中起到了非常重要的作用，包括减数分裂，卵子成熟以及老化。但是，H2S信号系统在人早期植入前胚胎发育中的作用并不清楚。本研究首次发现人早期植入前胚胎，包括卵裂期胚胎以及囊胚期胚胎都表达H2S合成酶，胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和胱硫醚-β-合成酶（CBS）基因和蛋白。CSE和CBS基因以及蛋白在囊胚期胚胎中的表达高于卵裂期胚胎。采用H2S荧光探针发现囊胚期胚胎在内源性H2S供体（L-半胱氨酸）孵育下能够生成H2S。添加外源性H2S供体——硫氢化钠（NaHS）能够明显促进卵裂期胚胎在体外培养形成囊胚、优质囊胚以及可利用囊胚。单细胞转录组测序结果显示NaHS处理能够引起228个差异基因表达。GO分析显示差异基因主要与蛋白修饰及代谢相关。KEGG分析显示差异基因显著性地富集与代谢相关的信号通路，包括2-氧代羧酸代谢、葡萄糖胺聚糖生物合成-硫酸角质素、类固醇生物合成、碳代谢以及氨基酸生物合成。其中6个关键基因的表达显著上调，包括神经表皮生长因子结构域1（NELL1）, 乌头酸酶1（ACO1）, 磷酸甘油酸变位酶（PGAM1）, TP53诱导糖酵解调节磷酸酶（TIGAR）, beta1,3-N-乙酰葡萄糖基转移酶2（B3GNT2）和糖磺基转移酶（CHST4）。结果表明硫化氢可能通过调节代谢相关基因表达参与体外胚胎发育过程的调控。. 胚胎条件培养液中检测到的胚胎分泌因子，包括人绒毛膜促性腺激素（hCG），IL-10，肿瘤坏死因子（TNF-α）以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。hCG与胚胎质量成正相关。IL-6浓度与囊胚质量的相关性是依赖于囊胚形成时间的，与第5天的囊胚质量成负相关，而与第6天的囊胚质量成正相关。种植胚胎以及非种植胚胎来源的SBCM中IL-6浓度并没有显著性差异。GM-CSF在SBCM中的检出率为50%，fg/mL 水平，并且其浓度与胚胎质量和妊娠结局成相关性。GM-CSF高、中、低浓度组之间的优质胚胎率、HCG 阳性率、临床妊娠率以及继续妊娠率都有显著性差异。ROC分析结果显示相比于形态学评分，GM-CSF或GM-CSF 联合形态学评分能够获得更好的曲线下面积来预测妊娠结局。结果表明GM-CSF或许可以作为预测妊娠结局和挑选胚胎的生物学指标。