基于G-四聚体和双功能DNA聚合酶的microRNA比色检测方法

qRT-PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) is the most classic and widely used microRNA detection method nowadays because of its high sensitivity and specificity. However, TaqMan probes used in qRT-PCR were fluorophore-labeled and chemical modified were very expensive and the qRT-PCR is dependent on expensive real-time qPCR system. In order to resolve these problems, the applicant intends to build a new microRNA detection method based on G-quadruplex and bifunctional DNA polymerase. In the new method, microRNAs act as primers, stem-loop colorimetric probes as templates, then after microRNA extension, reverse transcription, cDNA amplification, a lot of G-quadruplex molecules which are signal reporters could be produced and finally the colorimetric detection of microRNAs could be realized. Herein, the colorimetric probes are non-modified DNA, which are very economic. The bifunctional DNA polymerase which have the reverse transcription and PCR amplification ability could guarantee the sensitivity of the new method and simply the operation process. We hope that finally we can develop a new rapid, accurate, economic microRNA detection technology after this work.

qRT-PCR技术是目前最经典、应用最广泛的microRNA检测技术，具有高灵敏和高特异性的优点，但所使用的TaqMan探针需要荧光标记和化学修饰，成本高昂，同时需要依赖昂贵的实时定量PCR仪进行检测。针对这一问题，申请人拟基于G-四聚体核酶和双功能DNA聚合酶建立新的microRNA比色检测方法。该方法以microRNA为引物、比色探针为模板，依次进行microRNA延伸、逆转录、cDNA扩增，产生大量的G-四聚体核酶作为信号报告分子，最终实现microRNA比色检测。该方法的探针为非改性DNA，成本低廉；双功能DNA聚合酶能进行逆转录和PCR扩增，保证了方法的灵敏度并使操作简化。希望通过该项目的研究发展出快速、准确、廉价的全新microRNA检测技术。

本研究主要针对miRNA作为生物标志物日益增强的重要性而现有主流检测技术实用性低、推广难度高（如RT-PCR技术成本高、仪器依赖性强）的矛盾展开的，目的是建立与应用最为广泛和成熟的stem-loop RT-PCR具有相当灵敏度、特异性但又经济便捷的miRNA 比色检测新技术。研究中，我们沿用了具有高灵敏度的PCR扩增理念和特异性非常高的stem-loop RT-PCR技术中RT primer的设计理念，并引入具有AT-rich序列依赖性的有机小分子染料DISC2(5)和多功能的DNA 聚合酶TaqM1，设计了基于DISC2(5)/AT-probe和TaqM1的单酶miRNA 比色PCR检测技术。反应通过miRNA以AT-probe为模板的延伸反应及后续的RT-PCR扩增进行，最终产生富含AT的PCR扩增产物，使DISC2(5)能够与扩增产物结合产生肉眼可见的明显的颜色反应，从而实现了miRNA的快速比色检测。由于DISC2(5)的引入，新方法相比于基于TaqMan探针的检测方法，更为经济简便；相比于基于如SYBR green等非序列依赖性的染料而言，具有更高的特异性。研究过程中，TaqM1对miRNA延伸能力的发现，实现了miRNA的单酶检测，大大简化了反应组分。新方法最低可检测5fM的目标miRNA，在特异性方面能够明显区分一个碱基的突变，且能够避免miRNA前体的干扰。此外，新方法还能用于肿瘤细胞中miRNA的检测，对于提取的总RNA和直接的细胞裂解液都是可行的。.在本项目经费支持下，我们还开展了其他7项研究工作，包括：（1）基于重组酶的等温解开双链DNA方法的建立；（2）位点特异性剪切DNA的DNAzyme的体外筛选及性质研究；（3）一种基于串联PCR和小分子荧光基团的特异性DNA检测方法；（4）依赖核黄素特异性光敏剪切RNA的功能性单链DNA的获得；（5）以流式细胞术为基础的体内直接进化筛选方法；（6）基于功能核酸的DNA甲基化可视化检测；（7）基因检测应用于中药材及中成药中原药材的定量研究。