腺苷酸活化蛋白激酶经claudin-4调控颌下腺分泌的机制研究

紧密连接是调控颌下腺分泌的重要途径，但其机制尚不清楚。我们前期工作发现激活AMPK促进离体大鼠颌下腺的分泌，增加SMG-C6细胞紧密连接的通透性，并促进紧密连接蛋白claudin-4向膜转位。我们推测激活AMPK可以通过调节claudin-4来调控紧密连接的功能，从而促进颌下腺的分泌。我们拟①以离体大鼠颌下腺灌流为模型，在器官水平上观察AMPK对颌下腺唾液分泌的作用；②在培养的大鼠颌下腺腺泡细胞上证实激活AMPK可以增加细胞紧密连接的通透性；③在培养的细胞上观察claudin-4含量、分布与磷酸化的变化，并通过选择性敲低或过表达claudin-4，在分子水平上明确claudin-4在颌下腺紧密连接中的作用，并证明AMPK可以调节claudin-4，进而影响紧密连接的通透性。为揭示AMPK调控颌下腺分泌的机制、探讨紧密连接对颌下腺分泌功能的作用提供实验依据，具有重要的理论和临床意义。

本研究探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）经紧密连接分子claudin-4调控颌下腺分泌的作用机制，并阐明AMPK调控颌下腺紧密连接通透性的具体信号转导通路。选用AMPK激动剂AICAR对离体大鼠颌下腺进行灌流，检测颌下腺分泌功能的改变。以大鼠颌下腺腺泡细胞系SMG-C6细胞为模型，检测AICAR刺激对跨上皮电阻（TER）及对4 kDa FITC-右旋糖酐通透性的作用，采用免疫荧光法和western blot观察claudin-4分子的分布，western blot检测相关信号分子表达的改变，免疫共沉淀法检测claudin-4分子的磷酸化及claudin-4与其他紧密连接分子之间的相互作用。结果显示AICAR显著增加了离体大鼠颌下腺的分泌，用AICAR刺激SMG-C6细胞5至60min显著降低了TER值，并增加了对4 kDa FITC-右旋糖酐的通透性，提示AMPK激活后增加了SMG-C6细胞的旁细胞通透性。免疫荧光和western blot结果显示AICAR特异性诱导了claudin-4分子从细胞膜向细胞浆转位，但不影响claudin-1, -3, occludin和ZO-1的分布。AICAR刺激5至60min显著增强了SMG-C6细胞ERK磷酸化，使用ERK1/2抑制剂U0126和ERK1/2 siRNA后抑制了AICAR对TER的影响，并抑制了claudin-4从细胞浆向细胞膜的转位。免疫共沉淀结果显示AICAR激活了claudin-4丝氨酸（Ser）199位点的磷酸化并且增加了claudin-4和occludin之间的相互作用。使用U0126预孵育显著抑制AMPK诱导的claudin-4磷酸化以及claudin-4和occludin之间的相互作用。本研究证实AMPK激活后通过调节claudin-4分子的磷酸化及分布增加了SMG-C6细胞紧密连接的通透性，促进颌下腺的分泌，该作用可能通过ERK信号通路。本研究为揭示AMPK调控颌下腺分泌的机制、探讨紧密连接对颌下腺分泌功能的作用提供实验依据，具有重要的理论和临床意义。