常见病原微生物诱导黑斑蛙皮肤抗菌肽表达谱差异及其机制研究

Plenty of antimicrobial peptides (AMPs) from Amphibian provide a rich template for developing antimicrobial drug. AMPs in the same species are varied according to change of season, habitat, and environmental microorganisms, which lead to diversity of AMPs, so these AMPs could keep highly antimicrophyte activity. However, the mechanisms of AMPs’ diveristy was unknown. Firstly, dark-spotted frog (Rana nigromaculata) was induced by various bacteria, then the transcriptome and proteomics (iTARQ and Phosphorylation proteomics) were performed to analyze the discrepancy of AMPs by using skin. After bioinformatics analysis, the network was constructed and real time PCR and Wsetern blot will be performed for further verification. Our study will reveal the generation mechanism of AMPs of R. nigromaculata, and provideunderstanding for Amphibian immune mechanism and theoretical basis for the utilization of AMPs.

两栖动物皮肤是抗菌肽丰富的资源库，为多肽类抗菌药物开发提供了大量的模板。研究发现，同一物种抗菌肽表达谱因季节、栖息地、不同微生物诱导而异，这种差异导致抗菌活性的变化较大，因而细菌不易对其产生耐受现象。目前两栖动物产生抗菌肽表达差异的具体机制未明。本项目拟使用常见病原微生物处理黑斑蛙，利用转录组和蛋白组学手段检测黑斑蛙皮肤抗菌肽基因表达的变化，结合果蝇与人抗菌肽的产生机理，利用生物信息学手段推测黑斑蛙抗菌肽天然免疫通路，并利用实时定量PCR和Western blot对其进行验证。研究将阐明黑斑蛙在常见病原微生物诱导下抗菌肽表达谱的变化以及产生表达谱变化的机理，确定黑斑蛙抗菌肽天然免疫通路，为深入理解两栖动物的免疫机制提供有力的支撑，同时也为两栖动物抗菌肽的开发利用提供理论依据。

抗菌肽是生物体天然免疫系统重要的效应分子，因其具备抗菌谱广、特异性强、抗菌效率高等特点备受关注，现已有多种抗菌肽作为新型抗菌新药进行临床开发。抗菌肽的作用机制不同于传统抗生素，它主要作用于微生物的细胞膜，不易引起微生物抗药性，因此极有必要对其进行研究。两栖动物皮肤是抗菌肽丰富的资源库，为多肽类抗菌药物开发提供了大量的模板。目前两栖动物产生抗菌肽表达差异的具体机制未明。黑斑蛙具有生存范围广和抗菌肽种类适中等特点，是理想的两栖类动物抗菌肽免疫途径的研究对象。本实验使用常见病原微生物处理黑斑蛙，利用转录组和蛋白组学手段检测黑斑蛙皮肤抗菌肽基因表达的变化，结合果蝇与人抗菌肽的产生机理，利用生物信息学手段推测黑斑蛙抗菌肽天然免疫通路。首先通过高通量测序进行测序，对无参转录组进行了从头注释，注释的数据也作为蛋白组分析的参照。综合分析转录组学和蛋白组学数据，我们发现差异基因主要富集在防御反应、细胞外区域、肽酶抑制剂活性、肽酶调节剂活性、酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂活性、内肽酶调节剂活性和酶调节活性中。进一步的KEGG分析显示各组黑斑蛙的差异基因主要富集在B细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路和钙离子信号通路中。通过原核表达制备了相应的抗体，进行了验证无误。总体看，黑斑蛙受到病原菌刺激后产生抗菌肽的信号通路与哺乳动物和果蝇相似。