新根瘤菌III型因子和植物蛋白受体的鉴定以及在宿主特异性结瘤过程中的作用

高效益和可持续的粮食生产有赖于生物固氮。生长在植物根瘤中、特定的共生细菌（根瘤菌）可将大气中的氮气固定转化成氨而被植物利用，这种共生固氮可促进豆科植物（如大豆、菜豆、花生等）在缺氮环境中生长。根瘤的形成是根瘤菌一系列复杂浸染过程的结果，因此要从农业生产上改良及优化共生固氮需进行一系列的基础研究工作。在豆科宿主与根瘤菌的共生互作中，蛋白因子包括由III型分泌系统分泌的III型效应因子（简称为III型因子）是决定成功固氮的重要决定因子之一。本项目计划对根瘤菌III型效应因子的共生作用进行研究，并找出宿主植物中感应这些信号分子的受体蛋白。研究成果将进一步了解III型因子在宿主特异性结瘤中的作用，并提高人们关于根瘤菌对于中国农业重要性的认识。

由根瘤菌和豆科植物组成的生物固氮体系能极大地提高氮的利用效率。因而研究这两者之间固氮的分子机制对于实际应用中更好的推广生物固氮具有极其重要的意义。由于根瘤菌中的III型分泌系统和由此系统分泌的III型效应因子蛋白（也称为结瘤外在蛋白Nodulation outer protein, Nop）在共生过程中发挥了不可取代的作用，因而本课题筛选了具有T3SS的根瘤菌和根瘤菌NGR234，并研究了若干Nops的功能。.我们采集了广东省的花生品种并分离筛选出 11 株具有T3SS的根瘤菌。另外我们还从全国不同地区分离鉴定出7株可能拥有T3SS的根瘤菌。对根瘤菌菌株SYSU49和中华根瘤菌CCBAU83835进行全基因组测序。结果显示，在根瘤菌SYSU49中发现了5个tts基因簇和若干与已知nop同源的基因；在中华根瘤菌CCBAU83835中发现5个含有tts box的基因簇和7个包含有nop基因的基因簇。.为鉴定某一胞外蛋白的分泌是否依赖于T3SS，我们以根瘤菌NGR234中已知的III型效应因子NopL作为报告蛋白构建了报告系统。实验表明该报告系统不仅适用于自身根瘤菌中的胞外蛋白的检测，也同样适用于检测其他根瘤菌的胞外蛋白。通过此法发现中华根瘤菌CCBAU83835中有两个胞外蛋白分泌依赖于T3SS。通过构建SYSU49ΩrhcRST并与菜豆Yudou No. 1进行结瘤实验，我们发现T3SS能负向调节结瘤的进程。同时也构建了菌株83835ΩrhcRST并研究了其胞外蛋白分泌和共生表型。.我们还研究了根瘤菌NGR234中III型效应因子蛋白NopM和NopL的功能。通过制备NopM多克隆抗体，并在体外表达进行泛素化实验，验证了其具有泛素连接酶的活性。使用酵母双杂交的方法鉴定出了扁豆中若干可能与NopM相互作用的蛋白。表达NopL的酵母细胞生长受抑制，说明NopL具有细胞毒性作用。进一步在烟草和酵母宿主中表达NopL，发现其能抑制MAPK信号通路。双向电泳和质谱分析酵母里表达的NopL，发现其能被真核细胞中的MAPK磷酸化，并鉴定出了四个磷酸化位点。根瘤菌NGRΩnopL与菜豆(cv. Tendergreen)进行结瘤实验发现，NopL蛋白能够抑制宿主植物根瘤细胞的早衰。.成果为提高固氮效率和扩大宿主范围打下的基础