独活寄生汤调控Notch信号通路抑制淋巴管平滑肌细胞去分化治疗类风湿性关节炎的机制研究

Rheumatoid arthritis (RA) seriously affect the health and quality of life of patients. Lymph draining function plays an important role in the development and recurrence of the process of RA. Lymphatic smooth muscle cells (LSMCs) dedifferentiated, lose of contractile function, and lymphatic draining impaired in TNF-Tg mouse, thereby inhibiting dedifferentiated LSMC to maintain their normal phenotype and function, brings great significance to promote lymphatic flow, reduce inflammation in RA. DuHuoJiSheng Tang is the classic traditional Chinese medicine treatment for RA,and Our previous studies have shown that it promotes lymphogiogenesis, but the mechanism needs further investigation. . Our project applys TNF-Tg mouse models and LSMCs in vitro culture, near-infrared indocyanine green in vivo lymphatic imaging techniques, cell biology and molecular biology research methods, to study the inhibition effect of DuHuoJiSheng Tang in LSMCs dedifferentiation by regulating Notch signaling pathway to promote lymphatic drainage and treat RA.

类风湿性关节炎（RA）严重影响患者的健康和生活质量。淋巴回流功能在RA的发生、发展和复发过程中发挥重要作用。RA小鼠淋巴管平滑肌细胞（LSMCs）去分化，失去收缩功能，导致淋巴管回流障碍，加重RA的发生与发展，因此抑制LSMCs去分化，维持其正常表型和功能，对于促进淋巴回流，减轻RA炎症产物堆积具有重要意义。独活寄生汤是中医治疗RA的经典方剂，前期研究证明其促进淋巴增生，但作用机制尚待深入研究。. 本项目以TNF-Tg RA小鼠模型和体外培养LSMC为研究对象，采用近红外吲哚菁绿体内淋巴成像技术、细胞生物学和分子生物学等研究方法，研究独活寄生汤调控Notch信号转导通路抑制LSMC 去分化，促进淋巴回流，改善RA病理变化的分子机制。

目的：研究独活寄生汤及有效成分阿魏酸是否通过促进淋巴回流功能改善RA。.方法：采用tg(fli1:egfp；gata1：dsred)斑马鱼，给予VEGFR-3抑制剂刺激6小时后，在胚胎水中加入不同浓度的独活寄生汤及阿魏酸处理48小时，利用激光共聚焦观察斑马鱼淋巴管生成情况。TNF转基因（TNF-Tg）小鼠被选用为RA模型，WT小鼠作为对照。给2月龄TNF-Tg小鼠灌胃独活寄生汤或腹腔注射阿魏酸，给药后每2周进行关节炎临床症状评价，利用ICG-NIR检测给药后3月小鼠踝关节淋巴回流功能（clearance和pulse），取踝关节，进行Micro-CT、HE染色和TRAP染色。使用小鼠淋巴管内皮细胞株，利用细胞划痕实验用于检测迁移、Tube formation检测成管。用定量PCR、免疫组织化学、组织学和近红外成像检测1）从WT和TNF转基因小鼠滑膜组织分离提取的podoplanin +淋巴管内皮细胞（LECs）iNOS的表达，2）TNF诱导WT细胞iNOS的表达，3）iNOS抑制剂对淋巴管平滑肌细胞（LSMCs）功能性基因表达的影响，4）iNOS抑制剂对淋巴管收缩及回流和TNF转基因小鼠关节炎的严重程度的影响。.结果：独活寄生汤及阿魏酸可促进斑马鱼胸导管的发育，可改善TNF-tg小鼠足底部24h清除率，增加pulse，可改善TNF-Tg小鼠踝关节畸形，踝关节跖屈活动度。Mico-CT示独活寄生汤增加TNF-Tg小鼠踝关节骨量。独活寄生汤和阿魏酸均可增加TNF-tg小鼠踝关节骨面积，减少炎症侵蚀面积；减少破骨细胞面积。阿魏酸促进淋巴管内皮细胞成管和迁移。TNF-Tg小鼠滑膜来源LECs比野生型细胞有8倍iNOS mRNA表达增加。肿瘤坏死因子（0.1ng／ml）刺激iNOS表达增加40倍。TNF预处理LECs与lsmcs共培养造成LSMCs有功能性基因的表达减少。阿魏酸通过抑制一氧化氮产生阻止这种减少。.结论：独活寄生汤及有效成分阿魏酸能够促进斑马鱼淋巴管的生成,改善TNF-Tg小鼠踝关节淋巴回流功能。改善TNF-Tg小鼠踝关节畸形及活动度、增加踝关节骨量、骨面积，减少炎症侵蚀面积，降低破骨细胞的面积。阿魏酸促进淋巴管内皮细胞成管、迁移，抑制TNF刺激LECs表达iNOS，减轻NO造成LSMCs标记基因表达下降。