基于转录组测序对调控山茱萸环烯醚萜苷合成的bHLH类转录因子的筛选及鉴定研究

Corni officinalis is a wild medicinal plant under the national key protection. Iridoid glucosides are one of its main effective components, which is the new anti-cancer drugs. bHLH (basic-helix-loop-helix) transcription factor is one of the important transcription factors in Eukaryote. The previous studies have indicated that bHLH transcription factor are related to the regulation of iridoid glucosides biosynthesis. Applicant has finished the transcriptome sequencing of Corni officinalis fruits and obtained 25 genes which possible encoded bHLH transcription factor using 454 GS FLX high-throughput sequencing platform. On the basis of these results, the candidate genes of bHLH transcription factors will be screened by induced with methyl jasmonate through the Real-time PCR. Then the cDNA sequences of the candidate genes will be cloned using the rapid amplification of cDNA end (RACE) technology. The spatio-temporal expression profile of the bHLH transcription factor will be determined by real-time fluorescent quantitative PCR method. The subcellular localization of bHLH transcription factor will be studied based on the green fluorescent protein(GFP).The interaction protein of candidate genes of bHLH transcription factor will be located using yeast two-hybrid method, and the mode of action of the candidate genes will be determined. This study will lay the foundation for the molecular mechanism of the bHLH transcription factor involved in regulation of iridoid glucosides of Corni officinalis and will provide the basis for the variety breeding and genetic improvement of Corni officinalis.

山茱萸是我国野生药材资源的重点保护品种，环烯醚萜苷是其主要的活性成分，为新型的抗癌类药物。bHLH家族转录因子是真核生物中重要的一类转录因子，研究表明,bHLH转录因子参与环烯醚萜类物质的合成与调控。申请者已通过454 GS FLX高通量测序平台完成了山茱萸果实的转录组测序，获得了25条编码bHLH转录因子的候选基因。在此基础上，本研究利用Real-time PCR筛选受茉莉酸甲酯诱导表达的bHLH转录因子候选基因并克隆其全长cDNA序列。采用实时荧光定量PCR技术确定候选基因的时空表达模式，并进行基于GFP（绿色荧光蛋白）的亚细胞定位分析，通过酵母双杂交技术明确bHLH转录因子候选基因的互作蛋白，揭示候选基因的作用方式。本研究将为阐明bHLH转录因子调控山茱萸环烯醚萜苷生物合成途径的分子机制奠定基础，为山茱萸遗传改良和品种选育提供理论依据。

山茱萸是我国重点保护的野生药材资源，环烯醚萜苷是其主要的活性成分。bHLH是真核生物中一类重要的转录因子，为探讨bHLH转录因子如何参与山茱萸环烯醚萜类物质的合成与调控。本研究利用Illumina Hisseq 4000高通量测序平台，对处于成熟初期的山茱萸果实和叶片进行转录组测序，分别获得了60971652和57954134条高质量的reads和56,392 unigenes，通过与NR、GO、KOG、KEGG和Swiss-prot数据库比对注释，分别有41146、24336、10808、18435和25387个unigenes被成功注释。其中，GO数据库注释到的24336个unigenes又分为生物过程、分子功能和细胞组分三个大类。注释到KEGG数据库的18,435 个unigenes属于371个代谢途径。基因表达分析结果表明，在山茱萸果实（CoGS）和叶片（CoYP）中共有26,136个差异表达基因，以CoYP为对照，在CoGS中分别有11,735和14,402个表达上调、下调基因，其中4,585个基因呈显著性差异。差异基因KEGG通路富集分析显示，共有1670个差异表达基因被富集到226个KEGG通路。差异基因GO富集分析表明，有375和783个表达上调、下调基因。在山茱萸转录本中发现12,035个SSR标记位点，其中有7886个注释在外显子，SSR平均距离是18.27 bp。通过分析在山茱萸果实中搜索到了18,609个SNP，包含发生C/T转换的SNP有5755个，发生A/G转换的SNP有5976个，发生A/T、A/C、T/G、C/G颠换的SNP分别为1708、1611、1521和2038个。在山茱萸叶片中也搜索到20,641个SNP。利用PlantTFDB 3.0数据库，比对到44个转录因子，并分别注释不同数量的基因，如转录因子家族bHLH比对上的基因数量42个，设计引物， PCR扩增表达差异的bHLH转录因子cDNA序列，并通过实时定量PCR技术分析了部分bHLH在山茱萸果实和叶片中的表达情况，研究bHLH转录因子与环烯醚萜苷含量的相关性，bHLH40的实时定量结果表明，在环烯醚萜苷含量高的山茱萸果实中该转录因子的基因表达量也较高，初步说明bHLH40转录因子参与了山茱萸环烯醚萜苷的合成，为深入研究bHLH40参与环烯醚萜苷合成代谢的分子机理奠定基础。