内质网应激在戊型肝炎病毒感染致肝细胞损伤中的作用机制研究

Based on the theories of ultrastructural pathology and molecular pathology,the aim of this study will focus on indicating the correlation between the expression of HEV ORF2/ORF3 protein and the endoplasmic reticulum stress response and ultrastructural changes of hepatocyte infected with HEV,revealing the mechanism of lesion of hepatocyte infected with HEV.Using Mongolian Gerbil as an animal model, applying the methods and techniques of cell culture,cell fractionation,laser scanning confocal microscope(LSM),immunohistochemistry, immunoelectron microscopy, western bloting, PCR and in situ,the qualitative, quantitative and positioning analysis on ultrastructure expression of HEV ORF2 and ORF3 in hepatocyte infected with HEV will be observed. Using cell organelle fractionation technique to investigate the ultrastructural changes of endoplasmic reticulum membrane and function of protease,combining with pathological observation on other intracellular membrane system such as Goli apparatus and mitochondria,the mechanism of HEV replication, assembly and release in hepatcyte will be revealed systematically and comprehensively at ultramicro level. This research will provide theoretical basis for further study on diagnosis and preventative treatment of HEV,and reveal the pathogenesis of HE from a new train of thought.

本研究以超微病理学和分子病理学的理论为依据，以长爪沙鼠为实验动物，同时采用组织细胞培养技术、细胞器分级分离技术，结合激光共聚焦显微镜观察技术，运用超微病理学、免疫组化和免疫电镜技术、West Bloting技术、PCR和原位杂交技术，课题总体研究目标锁定于HEV感染过程中ORF2和ORF3的蛋白表达与肝细胞的细胞器内质网应激反应及其超微结构改变之间的关系，揭示HEV如何侵入靶细胞造成肝细胞损伤的发病过程及其机制。在观察HEV感染过程中ORF2和ORF3的蛋白表达在肝细胞内超微结构上的定性和定位的同时，应用细胞器分级分离技术，从研究内质网膜结构及其蛋白酶功能的超微变化入手，结合对细胞内膜系统的其他相关结构如高尔基体和线粒体结构和功能的病变观察，在超微水平上系统地、全方位地揭示HEV 在肝细胞内的复制、装配和释放的机制。从一个新的视角揭示HE的发病机理，为深入研究HE的预防和治疗提供理论依据。

应用本已建立的长爪沙鼠HEV感染模型，采用组织与超微病理学、组织细胞化学、免疫组织化学、RT-PCR、Western blot等技术相结合的方法，全面系统地从形态和功能两方面，在组织学和细胞超微病理学水平及分子水平上对沙鼠感染猪源HEV后肝脏的组织结构和超微结构变化进行了系统观察，并对引起细胞凋亡的相关通路的信号分子的表达进行了定位及定量观察。本研究首次将观察目标锁定于HEV感染过程中ORF2和ORF3的蛋白表达与肝细胞的内质网应激反应及其超微结构和功能改变之间的关系，揭示了HEV感染造成肝细胞损伤的发病机制。研究内容主要包括：1）系统观察研究了内质网结构和功能的改变在HEV感染致肝细胞损伤中的作用机制；2）系统观察研究了HEV感染对动物肠道黏膜免疫的影响；3）采用Real-time RT-PCR技术观察了猪源HEV在感染沙鼠体内各组织器官中的定位及病毒的载量；4）研究观察了线粒体结构和功能改变在HEV致肝脏损伤中的作用；5）首次初步观察了HEV感染后肝脏内细胞焦亡通路相关蛋白及其相关炎症因子表达量的变化；6）观察研究了HEV感染对沙鼠肾脏及睾丸的损伤作用及其机制；7）开展了宠物犬HEV及HBV感染情况的检测；8）开展了人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学观察；9）首次发现高山兀鹫可跨种间混合感染HEV，并引发高死亡率； .本研究从多角度揭示了HEV感染不仅可通过内质网应激介导的细胞凋亡通路、诱发肝细胞的凋亡，还可通过增加线粒体相关凋亡调节蛋白Bax、Bcl-2以及凋亡执行蛋白Caspase-3的表达量，并诱导肝脏细胞PI3K/Akt信号通路来引起肝细胞凋亡。除了促进细胞凋亡外，HEV感染还可启动肝细胞焦亡途径，引发一系列炎症相关因子的活化，这些正是HEV造成肝细胞损伤、肝脏炎症发生的重要机制。此机制的揭示，为深入研究HE的预防和治疗提供了重要的理论依据和新的研究思路