柑橘贮藏过程中汁胞粒化相关miRNA筛选及功能分析

Granulation seriously reduced the value of citrus products during storage, which limits the development of whole industry. A variety of influence factors that related to granulation in citrus fruits had been found in previous studies, but its mechanism were still not clear, especially the regulatory mechanism on posttranscriptional level. In this research, we use bioinformatic tools to predict and screen miRNA and the corresponding target genes that related to granulation during storage of Citrus Sinensis Osbeck, and discuss the function of these miRNAs during granulation process through the target genes analysis combined with postharvest storage experiments.

汁胞粒化现象是影响柑橘采后商品价值、制约我国柑橘贮藏保鲜和产业发展的瓶颈问题。前人研究已发现多种与柑橘采后汁胞粒化产生相关的影响因素，但其分子水平的调控机制尚不清楚，尤其是转录后水平的调控机制研究还未见报道。本研究以易发生汁胞粒化的广柑（Citrus sinensis Osbeck）为研究对象，采用生物信息学结合实验验证的方法，获得与广柑汁胞粒化相关的miRNA，并通过靶基因分析结合采后贮藏实验分析所得到的miRNA在采后汁胞粒化过程中的功能，从转录后水平揭示广柑贮藏过程中汁胞粒化的分子调控机制，为柑橘类水果采后汁胞粒化的进一步研究与调控奠定理论基础。

汁胞粒化是影响柑橘采后贮藏品质的关键问题之一，几乎在所有柑橘类水果中都有发生，是柑橘产业发展中亟待解决的瓶颈问题。本项目从miRNA在转录后水平调控的角度出发，研究miRNA与柑橘汁胞粒化的相关性，并对其功能进行分析。首先通过BLAST-2.2.28+程序筛选获得柑橘中候选的miRNA，并对其前体进行二级结构的分析，筛选得到柑橘中可能存在的且未见报道的12个miRNA；合并已报道的75个柑橘miRNA，运用psRNATarget和Blast2go程序对87个miRNA进行了靶基因预测及功能分析，最终预测获得与汁胞粒化相关的8个miRNAs家族共11个miRNAs可能参与了柑橘的汁胞粒化过程。以产量大且易发生汁胞粒化的广柑（Citrus sinensis Osbeck）作为研究对象，运用低场核磁成像及磁弛豫时间建立柑橘的粒化级别评价体系，并通过测定不同粒化级别中汁胞含水量，维生素C含量等与粒化显著相关的生理指标来验证此评价体系的可行性。在此评价体系的基础上将粒化果实划分级别，运用实时荧光定量PCR及相关性分析验证得到N-miR159a3p,csi-miR397,N-miR828,csi-miR827四个miRNA与甜橙的汁胞粒化程度显著相关，其相关系数分别达到了0.886,0.888,0.944,0.896。通过对csi-miR397的靶基因Cs6g06890.1，N-miR828的靶基因Cs1g17590.1 的相对表达量的测定及分析，证明csi-miR397和N-miR828与汁胞粒化程度和木质素含量均显著相关，可能是通过csi-miR397/Cs6g06890.1和N-miR828/Cs1g17590.1模式来调控木质素的合成从而达到对汁胞粒化调控的目的。csi-miR827的靶基因Cs5g10180.1的相对表达量则与柑橘粒化程度及磷含量显著相关，csi-miR827通过调控磷转运蛋白Cs5g10180.1来调控磷元素在柑橘体内的平衡，而磷元素具有对细胞中水分保持的功能，故其可能通过影响汁胞中水分的转移来达到对汁胞粒化进行调控的目的。这一结果为进一步阐明miRNA在柑橘汁胞粒化过程中的功能和调控路径研究奠定基础。