MicroRNA调控与氯吡格雷抵抗相关的CYP2C19表达的分子机制研究

基于氯吡格雷抵抗与CYP2C19多态性的相关研究，利用TaqMan Array MicroRNA Card初筛以CYP2C19 mRNA为靶基因的MicroRNA，再根据CYP2C19基因型用TaqMan MicroRNA分析法逐个定量检测，鉴定调控CYP2C19 表达的目标MicroRNA，合成前体分子和抑制剂，转染正常肝细胞后研究其对CYP2C19 mRNA表达、蛋白表达和酶活性的影响，最终确证调控CYP2C19基因表达的MicroRNA。进行氯吡格雷在Wistar大鼠的药代动力学研究并建立动物模型，考察CYP2C19诱导剂和抑制剂的影响及血小板聚集抑制率与代谢率的相关性，建立以聚集抑制率预测代谢率的数学模型。阐明MicroRNA通过转录后调控CYP2C19 mRNA，影响CYP2C19蛋白表达，改变氯吡格雷作用的分子机制，为探索逆转氯吡格雷抵抗提供新研究思路，保障临床用药更安全有效。

氯吡格雷是目前抗血小板聚集治疗最常用的药物之一，但15~30％的患者可能出现氯吡格雷抵抗，导致发生急性冠脉综合症的危险大大增加。氯吡格雷抵抗与多种因素相关，其中编码CYP2C19酶基因的多态性是最重要原因之一。miRNA 是一类具有调控其它基因表达、不编码蛋白质的小分子RNA，参与了20~30%人类基因组表达的调控，也参与了多种CYP酶系基因表达的调控，但至今国内外尚未见报道调控CYP2C19的miRNA。本研究旨在阐明miRNA通过转录后调控CYP2C19 mRNA，影响CYP2C19蛋白表达，改变氯吡格雷作用的分子机制。本研究完成了临床试验方案和知情同意书设计，并通过了四川大学华西医院伦理委员会审批，其中以LTA法检测血小板聚集率，以LC-MS/MS检测血浆中氯吡格雷及羧酸氯吡格雷的浓度。但因项目不能免费提供药物，不能支付患者进行血小板聚集率检测的费用和补偿费，且给药前、后两次采血量较多，多数患者拒绝参加试验。另外，实施过程中发现临床试验设计存在重大缺陷，代谢氯吡格雷的CYP2C19酶主要存在于肝微粒体，只有肝细胞内的miRNA才能调控CYP2C19表达，即氯吡格雷敏感人群和抵抗人群肝组织miRNA的差异，而非外周血miRNA的差异，才是真正可能调控CYP2C19表达的miRNA。但依据伦理学和术前15天需停用氯吡格雷的原则，不可能获得服用氯吡格雷达稳态患者的肝组织来进行miRNA研究。因此须先进行人原代肝细胞培养，证实原代肝细胞培养上清液中能检出预测的可能调控CYP2C19的miRNA，说明肝细胞能将这些miRNA分泌至全血中，才能实施原临床试验方案；否则利用患者全血标本进行影响CYP2C19表达的miRNA筛选，存在假阳性。在成功建立了大鼠原代肝细胞培养法后，经过近8个月的尝试仍未能成功培养人原代肝细胞，无法继续进行miRNA的筛选研究，试验暂时终止。为继续开展探索，本研究重新设计了动物实验方案，改以流式细胞仪检测VASP PRI反映血小板聚集情况。鉴于动物实验所需经费32万远超过本项目余下实施经费17.78万，且24只Wistar大鼠中能否筛选出3只氯吡格雷抵抗大鼠，有很大风险，有可能实验动物数量远超过预计，研究经费则更不足以完成动物实验，无法获得预期结果，因此课题组在设计了动物实验后，为避免浪费国家资源、无谓地投入研究经费，暂未实施动物实验。