与干旱胁迫相关的细胞膜Ca2+通道的功能验证

As an intracellular second-messenger, Ca2+ plays an important role within signal transduction of various stresses in plants. Under environmental stresses ( such as drought stress ), cytoplasmic Ca2+ concentration of plants shows specific changes, such as the plasmic membrane Ca2+ channel makes the extracellular calcium influx, leading intracellular Ca2+ concentration increases in a short period of time rapidly. However, the plant Ca2+ channels is poorly homology with the known Ca2+ channels of other species and limits of the current detection method. For these two reasons, the Ca2+ channels of plasmic membrane(PM) in plant has not been found out clearly yet. This study aims to obtain valuable mutants by screening Arabidopsis thaliana T-DNA population with fluorescent protein of jellyfish (aequorin) background. Then, the different aequorin luminescence-based Ca2+ imaging will be obtained from instantaneous calcium imaging via detecting drought stress of the whole plant level, and the gene of mutants can be obtained through the detection of T-DNA fragments inserted position. Meanwhile, this study will measure the content of intracellular free-Ca2+ by confocal laser technology and patch clamping plant electrophysiological experiments,the function compensation experiments of calcium imaging on Ca2+ channel mutant will be used,the overexpression and knockout mutants will be adopted in drought-stress physiological experiments, gene expression experiments for functional identification to specific response Ca2+ channel under drought stress. The study is of important significance in the understanding for molecular mechanism of plant resistance.

钙离子作为胞内的第二信使，对植物各种逆境信号转导起着重要作用。植物在受到环境胁迫（如干旱胁迫）时，细胞质中的钙浓度会出现特异性的变化，如细胞膜上的Ca2+通道会使细胞外的Ca2+内流，导致胞质内的Ca2+浓度在短时间内急速增加。但是，由于植物Ca2+通道与其它物种已知的Ca2+通道同源性不高以及检测方法的局限，在植物细胞膜上还没有发现功能明确的Ca2+通道。本研究以具有水母素荧光蛋白为背景的拟南芥突变体库为实验材料，在干旱胁迫的情况下，通过钙成像系统检测在植株水平获得的钙信号瞬间差异来获得有价值的突变体，并且通过检测T-DNA片段插入位置获得目的基因。同时，本研究将通过进行胞内游离钙含量测定、突变体钙成像的功能补偿实验、突变体植株干旱生理实验、基因表达分析及亚细胞定位研究等方法验证该Ca2+通道的具体功能，期望获得能够对干旱胁迫特异响应的Ca2+通道。这将有利于今后开展植物抗旱研究。

目前，对植物细胞膜上是否存在受干旱胁迫开启的钙通道研究很少，所涉及的信号通路也不清楚。我们的项目是利用以水母素荧光蛋白为背景的拟南芥T-DNA插入突变体库为实验材料，在以山梨醇作为干旱胁迫剂时检测突变体库萌发苗中钙激发光的强弱来确定可能的钙通道蛋白，继而进行蛋白功能验证。.本项目组筛选了大约3万个T-DNA突变体株系，所得候选突变体进行了3～4个世代的钙成像分析来确定表型遗传的稳定性，表型稳定的突变体又进行了胁迫特异性响应实验，以此来证明钙信号缺失确实是由干旱胁迫产生的。最终确定的突变体通过TAIL-PCR及接头酶连PCR的方法寻找T-DNA在拟南芥基因组中的插入位点来确定突变基因。通过Southern 印迹杂交我们确定该突变体为单位点插入，其钙信号不敏感特性是由我们所检测到的基因突引起的。最终，我们获得了一个定位在细胞膜上的六跨膜蛋白，该蛋白的功能未知，我们将其命名为DS (drought sensor)蛋白。Northern结果证明该基因受干旱胁迫诱导表达。.为进行DS功能验证，我们构建了水母素荧光蛋白（AQ）为背景的DS：：35S过表达突变体及ds-1、ds-2缺失突变体。在以山梨醇水溶液为胁迫剂时，我们发现，在400mM左右山梨醇胁迫时，缺失突变体表现出对干旱的敏感性，萌发率低，根和下胚轴变短，萌发苗易变黄且弱，而过表达突变体表现出对干旱胁迫的耐受性。在进行钙信号检测实验时，我们发现ds-1和ds-2表现出钙信号激发受阻的现象，而当ds-1和ds-2突变体重新转入DS基因，钙信号激发恢复正常。这样的突变体钙成像功能补偿实验说明DS直接参与受干旱胁迫诱导的钙通道信号转导。DS亚细胞定位实验也证明DS是位于植物细胞膜上的蛋白质。但是，由于在利用爪蟾卵母细胞进行胞内钙离子浓度变化的膜片钳实验并没有获得明显的电流变化，我们推测DS蛋白虽然直接参与了受干旱诱导的钙通道蛋白的早期信号转导，但并不是钙通道本身。DS的发现为下一步研究相关通道蛋白及蛋白互作，了解植物干旱诱导的上游信号转导打下重要基础。目前，整个研究结果正在进行整理。.项目发表论文9篇，其中SCI 1篇；授权发明专利2项，培养研究生2名。