临床分离角膜致病镰刀菌在角膜基质中的脯氨酸代谢对其致病性的影响及机制

Fungal keratitis is considered one of the most important cause of blindness, and Fusarium is the most common pathogen. The mechanism of fungal invasion of corneal stroma, cornea destruction and dysfunction of immune system has not been elucidated. Previous researches demonstrated that fungal nitrogen metabolism plays an critical role in fungal pathogenicity. However, no research about fungal nitrogen metabolism in cornea has ever been done, and it has been assumed that proline is one of the major nitrogen sources in cornea that Fusarium will take. Thus we come out with the hypothesis that fusarium's pathogenicity in cornea is associated with proline metabolism. We plan to verify that proline is the major nitrogen source for Fusarium in the cornea and then we analyze the relationship between proline metabolism and Fusarium pathogenicity as well as the regulatory role of proline metabolism enzymes.

真菌性角膜炎是严重的感染性致盲眼病，镰刀菌是最常见的致病病原，但其致病机制尚未研究清楚，目前药物治疗效果有限。我们在前期研究中发现氮营养对镰刀菌的生长至关重要，真菌从宿主获取氮源以维持生命活动是其具有致病性的前提。根据我们前期研究结果和文献报告结果推测，镰刀菌在角膜基质中优先利用和主要利用的氮源之一是脯氨酸。因此，本研究拟以临床分离角膜致病镰刀菌菌株为研究对象，首先验证脯氨酸是镰刀菌在角膜基质中利用的主要氮源之一，其次验证镰刀菌的脯氨酸代谢过程与其角膜致病性的相关性，即镰刀菌的脯氨酸代谢相关酶——脯氨酸氧化酶和Δ1-pyrroline-5-carboxylate（P5C）脱氢酶——对镰刀菌致病性的具体影响，并在镰刀菌感染角膜模型中确认脯氨酸代谢相关酶作为调控环节影响疾病发展的可行性，为临床开发新的治疗真菌性角膜炎的药物靶点提供理论基础。

真菌性角膜炎是严重的感染性致盲眼病，镰刀菌是最常见致病病原，但其致病机制尚不清楚，目前药物治疗效果有限。我们在前期研究中发现氮营养对镰刀菌的生长至关重要，真菌从宿主获取氮源维持生命活动是其致病性的前提。根据前期研究结果和文献报告结果推测，镰刀菌在角膜基质中优先利用和主要利用的氮源之一是脯氨酸。因此本研究拟以临床分离角膜致病镰刀菌菌株为研究对象，首先验证脯氨酸是镰刀菌在角膜基质中利用的主要氮源之一，其次验证镰刀菌的脯氨酸代谢过程与其角膜致病性的相关性，即镰刀菌的脯氨酸代谢相关酶对镰刀菌致病性的具体影响，并在镰刀菌感染角膜模型中确认这两种酶作为调控环节影响疾病发生、发展的可行性。研究首先检测人角膜、常用实验动物角膜中氨基酸种类、含量和比例，确认脯氨酸在人角膜基质内的存在。常用实验动物角膜中氨基酸比例都不与人角膜完全重合，大鼠和猪角膜与人角膜的脯氨酸比例最接近。进一步，检测脯氨酸为单一氮源对镰刀菌致病性的影响，发现相比谷氨酰胺和甘氨酸，单次感染菌株和复发感染菌株在脯氨酸为氮源的培养基中生长情况最好，证实脯氨酸与镰刀菌的致病性，特别是复发感染有关系。利用脯氨酸代谢酶抑制剂（L-THFA）对脯氨酸代谢过程进行干预，发现镰刀菌的生长受到明显抑制，与L-THFA浓度具有相关性。转录组检测发现随着L-THFA浓度增加镰刀菌的生长、代谢等重要生命活动均受到严重打击破坏。根据角膜中不同氨基酸成分比例关系，制作混合氨基酸为氮源的镰刀菌培养基并添加L-THFA，发现不同氨基酸对镰刀菌的生长和致病性有不同作用，且均能受到L-THFA的抑制影响。在镰刀菌感染角膜模型中给予L-THFA，发现L-THFA可以有效抑制镰刀菌在角膜基质内的生长和侵袭，对镰刀菌感染性角膜炎中角膜胶原具有保护作用。本研究结果证实了脯氨酸代谢在镰刀菌感染角膜炎中的重要致病作用，为临床开发新的治疗真菌性角膜炎的药物靶点提供理论基础。