基于pH相关氨基酸定位分析的双功能木聚糖酶耐酸性突变研究

木聚糖酶能够解除非淀粉多糖的抗营养作用而成为重要的饲用酶制剂，项目组筛选到兼有葡聚糖酶功能的高活性木聚糖酶XynIII，更有优越性；但是胃酸低pH环境(pH 2-3)影响酶活性，成为饲用酶应用中的严重障碍；蛋白质工程可提高其低酸适应力，最棘手问题是确定与pH相关氨基酸及位置。本项目用氨基酸二联体定位策略确定氨基酸的作用及位置：通过计算木聚糖酶序列中氨基酸与酶pH关系的家族特征，得到pH相关氨基酸二联体方程，确定与pH正相关氨基酸在XynIII序列中的位置，进而确定在结构中的位置，根据与活性中心的关系选择候选突变氨基酸；将它们突变为与pH负相关氨基酸，降低酶作用pH；并进行双点、多点氨基酸叠加突变，筛选胃酸适应能力增强的突变酶；阐明突变氨基酸及其叠加效应对pH影响，探讨酶适应酸性环境机理，奠定耐酸性酶分子改造理论。本项目首次探讨了氨基酸定位策略，有望创立理性分子改造新体系，获得改造新途径。

木聚糖酶用于动物饲料中可提高饲料利用率及日增重率，但是酸性环境限制了酶活性发挥，为得到低pH环境发挥活性的木聚糖酶，需要酶分子改造及探讨耐酸性机理，然而哪种、哪个位置氨基酸与pH有关？所以氨基酸定位研究特别重要。.基于氨基酸二联体含量与最适pH相关研究得到的方程“pH = 5.0－0.67*[YS]+1.22*[GR]+ 1.14*[KR] + 0.82*[MR] + 0.34*[SY]”，正相关二联体为：GR、KR、MR、SY；负相关二联体为：YS。对黑曲霉木聚糖酶定位研究，选择9个位置氨基酸突变为丝氨酸（Ser），得到负相关二联体YS，pH将向酸性环境偏移。经融合PCR定点突变，连接T-载体，转接pET20b，转化E.coli BL21（DE3），筛选并经DNA测序，IPTG诱导，纯化，检测酶性质。.结果：与野生酶pH 3.8相比，四个突变体酶pH向酸性方向偏移，其中2号、7号、9号三种纯酶pH 3.6，偏移0.2U；6号突变粗酶pH 3.4，向酸性方向偏移0.4U，位置分别为：2号（YN11S）；7号（YQ109S）；9号（YQ165S）；6号（YP76S），6号基因3’端缺失组氨酸标签，无法纯化。8号突变（YF131S）；3-7双突变（YW30S/YQ109S）因粗酶活性较低，没有纯化。pH2.6时，2号活性为最大活性48%，7号57%，9号65%，均比23号34%有较大提高，9号提高近1倍，突变酶均比野生酶pH2.6活性高，可用于饲料添加剂。.意义：1氨基酸二联体定位方程有效，可指导酶分子pH性质改造；2得到适应酸性能力更强的酶分子2/7/9/6号；3提供了理性改造酶分子pH新方案；4推测耐酸性机理为Ser参与底物结合，与Rusell rule不同“酸性氨基酸（D/E）多则其耐酸性较强，而中性或碱性氨基酸多则耐碱性较强，经序列比对、定点突变证实活性中心附近，如为酸性氨基酸则其pH则较低，如为中性，则其pH则较高”；5探讨了高通量筛选方案。.成果：发表5篇SCI文章（2篇JBC），累计因子24.4；省优秀自然科学论文奖一、二等各一项。出版《基因工程原理与实验指导》。晋升正、副教授各一人、增选为中国酶工程专业委员会委员。培养6名硕士生毕业（考取中科院、江南大学博士各1名）、1篇推荐河南省优秀硕士论文，2名在读生获首首届国家奖学金。