甘蔗SCSMV抗性候选基因eIF4E的克隆及功能分析

Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) is the main pathogen that restricts sugarcane production. Eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) is an indispensable factor for infection of RNA virus with plant. Mutating or knocking out the key sites of eIF4E can affect the virus-plant interaction and result in resistance to the virus. The study found that the interaction between SceIF4E1 and SCSMV-VPg, but the mutant sites and mutant genes of eIF4E were no reported in sugarcane. Therefore, this project decided to clone the eIF4E from high resistance germplasms and high susceptible germplasms to SCSMV in the National Nursery of Sugarcane Germplasm Resources (NNSGR, Kaiyuan, China). The mutant sites would be discovered by the candidate genes association analysis of resistance to SCSMV. A series of mutant genes were successfully constructed by the performance of point mutations. Interactions were tested by bimolecular fluorescence complementation assays in sugarcane cell. Finally, this project gains mutant eIF4E that do not interact with SCSMV-VPg and lay the foundation for cultivating eIF4E mediated resistance of new sugarcane varieties.

甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus SCSMV)是制约甘蔗生产的主要病原。真核翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E eIF4E）是多种RNA病毒侵染植物的必需因子，通过突变或敲除eIF4E关键位点能影响病毒-植物的互作，引起植物对病毒的抗性。研究发现了甘蔗eIF4E (SceIF4E1)能与SCSMV-VPg互作，但eIF4E的突变位点及突变体未见报道。为此，本项目通过克隆国家甘蔗种质资源圃中高抗和高感SCSMV甘蔗种质中的eIF4E基因，利用候选基因关联分析法发掘与SCSMV抗性相关突变位点。根据突变位点构建一系列eIF4E突变基因，利用双分子荧光互补技术直接在甘蔗细胞内验证它们与SCSMV的互作，获得不与SCSMV互作的eIF4E突变体，为创制抗SCSMV的甘蔗新种质奠定基础。

甘蔗是关系国计民生的重要战略物资，甘蔗花叶病是甘蔗的“癌症”，其主要病原为SCSMV，近年该病原在蔗区不断扩展，给甘蔗生产带来了很多损失。真核生物翻译起始因子 4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，简称 eIF4E）参与植物与病毒的互作, 是多种 RNA病毒侵染植物的必需因子。本研究首先对国家甘蔗资源圃中不同来源的221份种质通过人工切茎接种、RT-PCR检测、抗性聚类分析的方法进行抗性再评价，最后筛选出到10份高抗SCSMV和10份高感SCSMV种质，随后对高抗和高感SCSMV种质进行SCSMV保守区cp基因进行检测和分析，证实甘蔗品种对SCSMV的抗性差异是甘蔗品种本身的差异造成的。其次采用同源克隆方法获得抗病、感病品种eIF4E 基因序列，分别命名为SueIF4E-R和SueIF4E-F，通过生物信息学分析发现抗病、感病品种eIF4E 基因在结构上差异不大，系统进化分析表明它们均与甘蔗属材料同源性较高，SueIF4E-R与割手密（AWA44706）的eIF4E亲缘关系最近，说明他们可能具有类似的功能。不同抗性品种eIF4E的多样性分析表明虽然抗感品种中均能扩增到eIF4E 基因，但在基因序列上还是存在差异。eIF4E基因中与SCSMV抗性的关联发现抗感eIF4E 基因序列存在26个差异SNPs，其中7个SNPs为高抗SCSMV材料所特异，12个SNPs为高感SCSMV材料所特异，7个SNPs为高抗和高感SCSMV材料所共有，26个SNPs均同义突变，其中4个SNPs位点的突变导致了氨基酸的替换，并与抗性相关。对甘蔗eIF4E基因中与SCSMV抗性相关联的26个SNP位点构建突变体，用酵母双杂技术(Y2H)和双分子荧光互补技术（BiFc）验证与 SCSMV-VPg 的互作，获得不与 SCSMV-VPg 互作的 eIF4E 突变体。本项目的实施为创制和获得SCSMV 广谱抗性种质奠定基础。