基于骨髓基质细胞研究肿节风调节微环境促进巨核细胞增殖的作用机制

On clinic, thrombocytopenia was seen in Myelodysplastic syndrome, Leukemia, systemic lupus erthematosus and so on, also induced by radiotherapy and chemotherapy of malignant tumor. The results of our previous studies had proven that Sarcandra glabra increased the number of mature megakaryocyte and enhanced the number of platelet. And closely related with bone marrow microenvironment, but the mechanism is still unclear. We believe that "Sarcandra glabra indirectly stimulates megakaryocytopoiesis via regulate bone marrow microenvironment based on bone marrow stromal cells". This subject will be planned to culture bone marrow stromal cell and megakaryocyte in vitro using the thrombocytopenia mice model, and establish the co-culture system of bone marrow stromal cells and megakaryocytes by using permeable supports (Transwell). The relationship between the state changes of stromal cells and the proliferation of megakaryocytes as the starting point, using molecular biology techniques to analysis the effect of Sarcand glabra on bone marrow microenvironment and stromal cells itself secrete cell factors. Adopt immunohistochemistry and electron microscopy to analysis the relationship between the changes in the bone marrow microenvironment and the proliferation of megakaryocytes. The mechanism of Sarcandra glabra promote prolferation and differentiation of megakaryocyte via improve the bone marrow microenvironment will be investigated and elucidated, thus contributing provide new ideas and new targets for prevention and treatment of thrombocytopenia.

血小板减少症常见于白血病、骨髓增生异常综合症、红斑狼疮等难治性疾病，以及恶性肿瘤放、化疗过程中，对人们健康危害极大。课题组前期研究表明肿节风促进骨髓巨核细胞增殖，提升血小板效果显著，且和骨髓细胞微环境密切相关，但作用机制不详。我们认为"肿节风主要通过调节骨髓基质细胞影响微环境间接促进巨核细胞增殖"。本课题拟采用血小板减少动物模型的骨髓基质细胞和巨核细胞体外培养，并建立transwell共培养体系，以基质细胞质和量的改变与巨核细胞增殖成熟之间的关系为切入点，采用分子生物学技术研究肿节风干预后微环境中基质细胞和巨核细胞增殖相关多个因子及其受体变化；结合骨髓切片免疫组化和电子显微镜技术，原位分析微环境中基质细胞与巨核细胞的相互作用。阐明骨髓细胞微环境中基质细胞与巨核系细胞增殖成熟的关系，揭示肿节风通过基质细胞改善微环境，进而促进巨核细胞增殖分化的作用机制，为血小板减少症的防治提供新思路和新靶点。

血小板减少临床上典型代表为免疫性血小板减少症，也常见于白血病、骨髓增生异常综合症等难治性疾病，以及伴随恶性肿瘤化学药物治疗过程中，影响治疗效果和进程。巨核细胞是血小板的前体细胞，其增殖分化成熟障碍是血小板减少患者发病和治疗的关键，与骨髓微环境及其中的基质细胞关系密切。为验证我们的假说 “肿节风通过调节骨髓基质细胞影响微环境间接促进巨核细胞增殖”，利用制备的抗血清和阿糖胞苷分别建立免疫性血小板减少症和化疗药物所致继发性血小板减少症动物模型，考察肿节风对外周血小板、巨核细胞数目及分化程度的改善。研究结果显示肿节风总黄酮显著提升模型动物血小板数目，明显提高动物骨髓中巨核细胞数目和多倍体比例，改善体外培养骨髓基质细胞贴壁率和生长状况；免疫组化结果显示肿节风明显促进骨髓微环境中基质细胞TPO和SDF-1的表达量，显著增加骨髓巨核细胞中C-mpl和CXCR-4的表达。体外培养骨髓基质细胞和巨核细胞，建立骨髓基质细胞-巨核细胞共培养体系，利用肿节风总黄酮提取物和含药血清（血浆）研究其对骨髓基质细胞和巨核细胞的影响。研究结果显示肿节风总黄酮及其含药血清和血浆都可以直接促进巨核细胞增殖，也能明显促进基质细胞增殖，使其数量增加，同时促进基质细胞分泌TPO和SDF-1等细胞因子，间接促进培养体系中巨核细胞“量”的增加，同时加速巨核细胞分化成熟相关“质”的变化：多倍体细胞比例增多，巨核细胞CD61表达量增加。结合整体动物实验免疫组化结果，表明肿节风总黄酮通过影响骨髓中基质细胞生长状况，以及促进其分泌有利于巨核细胞增殖分化细胞因子，改善了骨髓微环境，通过TPO-C-mpl和SDF-1-CXCR-4信号通路促进巨核细胞增殖分化成熟生成血小板。本研究为血小板减少症的防治提供新的思路和靶点，为肿节风的临床应用提供实验依据。